云南大理猪弓形虫虫株毒力研究、墨江县新生儿弓形虫血清流行病学调查

发布时间：2020-05-23 21:42

【摘要】：目的本研究共两部分,第一部分:从免疫学、分子生物学、病理学等方面对大理猪弓形虫Toxo DB#9型虫株的毒力进行研究,探究ToxoDB#9型弓形虫速殖子的毒力特点,从而为深入研究弓形虫感染宿主的致病机制提供一定的实验数据;第二部分:调查墨江县少数民族地区新生儿弓形虫感染情况并分析其危险因素,为本地区优生优育工作的开展提供科学依据。方法本研究第一部分(云南大理猪弓形虫虫株毒力研究)大理猪ToxoDB#9型弓形虫速殖子由实验室保存。6-8周龄健康清洁级昆明小鼠共200只,随机分为10组(8个ToxoDB#9型弓形虫感染组,1个空白组和1个RH株组),每组20只,雌雄各半。腹腔注射方式感染接种,其中8个ToxoDB#9型弓形虫感染组接种剂量为:10~0、10~1、10~2、10~3、10~4、10~5、10~6、10~7个;RH标准株对照组接种10~3个、空白组注射生理盐水,各组分笼饲养,同一环境采食饮水。感染处理后每天观察小鼠饮食、活动、精神状态和发病情况,隔天称小鼠体重,记录体重变化,记录小鼠死亡时间;在感染后第5天、10天、20天、30天、45天,每组随机取雌雄小鼠各1只,摘眼球取血,离心取上清液,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清弓形虫IgG抗体,并取脾脏组织PCR检测扩增弓形虫特性B1基因,以确定小鼠获得感染和死亡,从而统计各组小鼠的感染率和死亡率。将ToxoDB#9型10~2、10~4、10~6感染组分别定义为低、中、高剂量组,感染后第3天、7天、15天、45天,随机从低、中、高剂量组与空白对照组、RH株组中抽取雌雄小鼠各1只,摘眼球取血,分离上清,ELISA法检测血清细胞因子IL-2、IL-12和IFN-γ,无菌条件下取出各组织浸泡于福尔马林固定液,第二天常规石蜡切片进行HE染色,检查病理变化。第二部分:(云南墨江县新生儿弓形虫血清流行病学调查)原始数据资料来源于2016年10月至2017年4月在墨江县人民医院妇产科接生的311例新生儿与对应产妇的血清,用ELISA法检测血清中弓形虫IgG抗体,并用X~2检验法结合分析不同民族、胎儿性别、孕妇年龄、妊娠史等因素和弓形虫血清抗体阳性率的差异性。结果1.1在第一部分研究中,腹腔注射感染后24h,RH株组小鼠精神萎靡,活动量略下降;"g10~5 ToxoDB#9型剂量组小鼠精神状况略微下降,活动量略减少,饮食饮水正常;"f10~4剂量组与空白组小鼠采食、饮水、活动均正常。感染后48h,RH株组小鼠精神状况不佳,采食饮水量减少,有1只小鼠眼结膜出现红肿;"g10~3 ToxoDB#9型剂量组小鼠精神状况略微下降,喜卧,背略弓,饮食饮水正常;"f10~2剂量组与空白组小鼠采食、饮水、活动均正常。感染后72h,"g10~3剂量组与RH株组小鼠均出现精神沉郁、喜卧,采食饮水量明显减少,被毛逆立,背略弓的症状,10~6剂量组2只小鼠腹部膨隆症状,10~5、10~6、10~7剂量组均有2只小鼠眼结膜出现红肿;"f10~2剂量组与空白组小鼠未见异常。15日后各感染组急性期耐过后,存活小鼠精神状态、活动量、饮食饮水趋近正常;ToxoDB#9型虫株10~5、10~6、10~7剂量组各有2、4、3只小鼠四肢、颈部部位出现肿块;"f10~4剂量组与空白组小鼠正常生长,未见异常情况。1.2 10~0、10~1及≥10~2剂量组中的弓形虫感染率分别为10%(2/20)、40%(8/20)及100%(20/20)。10~0、10~1剂量组与空白组小鼠未出现死亡;≥10~2剂量组皆可引起实验小鼠死亡。1.3 ELISA检测血清IgG抗体,结果显示:感染后第3天,感染组、RH株组、空白组小鼠血清IgG抗体均为阴性;感染后第5天,ToxoDB#910~6剂量组小鼠血清IgG抗体阳性,RH株组、空白组与其他各感染组均为阴性;感染后第10天,10~5、10~6、10~7剂量组和RH株组为阳性,其余各组检测结果为阴性;感染第后20天、30天、45天,除10~0剂量组和空白组之外,其余组小鼠血清IgG抗体检测结果均为阳性。1.4 PCR检测脾脏组织弓形虫特性B1基因,结果显示:感染后第5天,RH组、"g10~4剂量组小鼠PCR阳性,而空白组与"f10~3剂量组为阴性;感染后第10天,"g10~3剂量组与RH株组检测结果为阳性,其余各组检测结果为阴性;感染后第20天,空白组和10~o、10~1剂量组检测结果为阴性,RH株组与其余各剂量组检测结果为阳性;感染后第30天、45天除10~0剂量组和空白组之外,其余感染组均为阳性。1.5血清细胞因子检测结果显示:各感染组小鼠血清IFN-γ高于空白组、呈现剂量增加数值升高的趋势,于感染后7天达到最高,之后下降,至感染初期水平。低剂量组于感染后第15天后逐步上升。低剂量组、中剂量组、与空白对照组、RH组波动范围较小,高剂量组波动范围较大;高剂量组小鼠血清IL-2水平明显高于其它组,并于感染后第7天达到最高,之后略下降,而后又上升。而低剂量组、中剂量组、与空白对照组、RH株组的IL-2水平波动范围较小;中剂量、高剂量、RH株组小鼠血清IL-12水平高于空白组和低剂量组,中剂量组RH株对照组于感染后7天达到最高,高剂量组则于感染后15天达到峰值。1.6感染组小鼠剖检肉眼观察结合病理切片发现,10~5、10~6、10~7剂量组小鼠脏器组织均有不同程度的损伤,其中10~6剂量组最大为典型:脾肿大、淤血;肾肿大;肝肿大、淤血,肝脏变性、坏死;肺肿胀实变,肺炎;肺与肾脏病理切片镜检可见,肺泡间增宽、肾小管上皮脱落坏死。2在第二部分研究中,墨江县人民医院妇产科接生的311份胎儿脐血血清弓形虫IgG抗体总阳性率为17.36%(54/311),其中哈尼族、汉族、彝族、拉祜族、其他少数民族弓形虫IgG抗体阳性率分别为17.01%(33/194),18.05%(13/72),15.00%(3/20),25.00%(2/8),17.65%(3/17)。不同民族、新生儿性别、孕妇年龄、妊娠史之间弓形虫IgG抗体血清阳性率差异无统计学意义(P0.05)。结论1.与RH株相比,大理猪ToxoDB#9型弓形虫虫株感染昆明小鼠毒力弱于RH株。2.云南墨江县新生儿弓形虫IgG抗体总阳性率为17.4%。
【图文】：

细胞生长,情况,虫株,无菌操作

图 1.1VERO 株细胞生长情况Figure 1.1 VERO cell growth体外细胞培养速殖子及纯化1）打开液氮罐，立即拿出冻存的弓形虫 ToxoDB#9 虫株和 RH 虫株，在彻底融化后（约 2-3 min），将其转移至无菌操作台操作，无菌操作使用移，移至高压灭菌 10ml 试管中（预先加入 2-3ml10%细胞维持培养基），35min，弃上清液，后接种到培养好的 vero 细胞中，置 37℃ CO2恒温培养箱更换一次维持培养基。2）待虫株布满培养瓶后，将虫株与细胞刮入培养基，开始以 20 号过滤针次，继而以27号针头重复破裂3 次，采集虫体悬液，室温3500 rpm /min 离心液。用适量 PBS 水漂洗沉淀，再用 10ml10%不含双抗培养液重悬，此过收集并计数使用。

弓形虫速殖子,生长情况,细胞内,速殖子

图 1.2 弓形虫速殖子在 VERO 株细胞内生长情况Figure1.2 Growth of T. gondii tachyzoites in VERO strain cells鲍尔计数板上加盖玻片，以微量移液器抽吸 10μl 混匀的速殖子入改良纽鲍尔计数板与盖玻片间的间隙，静置 2 min，光学显微角的四个大格中速殖子总数。速殖子浓度计算公式为：速殖子/ml=（四个大个格子内的速殖子总数/4）×104殖子浓度时，加适量 PBS 稀释，吹打均匀，显微镜下计数，直至物模型的建立机分为 10 组（8 个感染组，，1 个空白组和 1 个 RH 标准株对照组分别腹腔接种 ToxoDB#9 100、101、102、103、104、105、106、腹腔注射接种小鼠，接种前一日饮用水改为地塞米松液（10μg饲养，正常采食饮水。
【学位授予单位】：大理大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.7;R722.1

【参考文献】