CPT1A、MTP基因干扰对三种糖诱导的鹅肝细胞脂质沉积的影响

发布时间：2020-05-23 23:54

【摘要】：肝脏在维持机体糖脂代谢平衡中扮演着重要角色。本研究室前期在细胞水平的研究表明,葡萄糖和果糖诱导鹅肝细胞脂质沉积的能力不同,提示不同类型糖诱导肝细胞脂质沉积能力不同。CPT1A、MTP是脂质代谢中脂肪酸氧化和脂质转运途径上起关键作用的基因。本研究以天府肉鹅母系为研究对象,克隆鹅CPT1A、MTP基因的CDS区序列,并进行生物信息学分析;采用半原位二步胶原酶灌注法分离培养鹅原代肝细胞,通过葡萄糖、果糖和蔗糖分别处理体外培养的鹅原代肝细胞并分别转染CPT1A、MTP干扰质粒,采用MTT检测细胞活力,荧光定量PCR法、Elisa试剂盒检测法以及油红O染色法检测脂肪酸合成,VLDL-TG分泌转运以及脂肪酸合成、脂肪酸氧化和脂质转运途径的相关指标来反映脂质代谢的变化,初步探讨CPT1A、MTP干扰对三种糖诱导的鹅肝细胞脂质沉积的影响,能够更为清晰的了解糖诱导肝脂质沉积的机理。主要结果如下:1.通过设计分段引物进行PCR扩增并拼接获得鹅CPT1A、MTP基因CDS区序列。鹅CPT1A、MTP基因的CDS区序列分别编码770、893个氨基酸。2.分别转染CPT1A、MTP干扰质粒24小时后,Q-PCR检测显示CPT1A、MTP干扰效率分别达51.3%、62.6%,表明CPT1A、MTP干扰鹅肝细胞成功。3.转染CPT1A干扰质粒后,FAS、ACCαmRNA表达量无显著变化,SREBP1mRNA表达量显著下降(P0.05),FAS、ACCα激酶含量显著升高(P0.05);CPT1A、ACOX1、PPARαmRNA表达量显著下降(P0.05),CPT1A激酶含量显著降低(P0.05);MTP、APOB、DGAT1 mRNA表达量显著下降(P0.05),MTP、APOB激酶含量无显著变化。油红O染色显示鹅肝细胞干扰CPT1A使细胞内脂滴颗粒增多,脂质沉积明显,同时细胞内外TG含量增加,而胞外VLDL含量减少。4.转染MTP干扰质粒后,FAS、ACCαmRNA表达量显著升高(P0.05),SREBP1 mRNA表达量显著降低(P0.05),FAS、ACCα激酶含量显著升高(P0.05);CPT1A、ACOX1、PPARαmRNA表达量无显著变化,CPT1A激酶含量无显著变化;MTP、APOB mRNA表达量显著降低(P0.05),DGAT1 mRNA表达量无显著变化,MTP激酶含量显著降低(P0.05),APOB激酶含量无显著变化。油红O染色显示鹅原代肝细胞干扰MTP后,细胞内脂滴颗粒增多,脂质沉积明显,同时胞内外TG和胞内VLDL含量增加,而胞外VLDL含量减少。5.与单独葡萄糖或单独蔗糖处理相比,葡萄糖或蔗糖处理同时干扰CPT1A后,FAS、ACCα、SREBP-1基因表达量及FAS、ACCα蛋白激酶含量升高,CPT1A、ACOX1基因表达量降低,MTP、APOB基因表达量及MTP蛋白激酶含量降低。与单独果糖处理相比,果糖处理同时干扰CPT1A后,FAS、ACCα、SREBP-1基因表达量及FAS、ACCα蛋白激酶含量降低,CPT1A、ACOX1基因表达量降低,MTP、APOB基因表达量及MTP蛋白激酶含量降低。油红O染色显示三种糖分别处理同时干扰CPT1A使细胞内脂滴颗粒增多,脂质沉积明显,同时细胞内TG和胞内VLDL含量增加。6.与单独葡萄糖或蔗糖处理相比,葡萄糖或蔗糖处理同时干扰MTP后,FAS、ACCα、SREBP-1基因表达量及FAS、ACCα蛋白激酶含量升高,脂肪酸氧化途径上的重要基因表达量及其蛋白激酶含量无显著变化,MTP、APOB基因表达量及MTP蛋白激酶含量降低。与单独果糖处理相比,果糖处理同时干扰MTP后,FAS、ACCα、SREBP-1基因表达量及FAS、ACCα蛋白激酶含量降低,CPT1A、ACOX1基因表达量升高,MTP、APOB基因表达量及MTP蛋白激酶含量降低。油红O染色显示分别三种糖处理同时干扰MTP使细胞内脂滴颗粒增多,脂质沉积明显,同时细胞内外TG和胞内VLDL含量增加。
【图文】：

序列,样本资料,重比,序列

2.3 试验数据分析利用 SPSS 12.0 软件对数据进行统计分析，，数据处理软件为 Excel 、SPSS 22 、GraphPad 7，采用 T-test 进行样本资料两组间显著性分分析，多组之间比较采用方差分析，利用 Tukey、邓肯法多重比较的显著性分析，用来分析数据的统计意义，所有数据以平均值±标准差（Means± SE），形式表示。统计学上， P < 0.05 代表差异显著。3 试验结果3.1 鹅 CPT1A、MTP 基因 CDS 区的拼接与鉴定采用普通 PC 的方法获得条带单一、明亮的目的片段，经测序为相应分段引物所得产物。采用 DNAStar 对分段产物序列结果进行拼接，如图 1 所示得到了鹅 CPT1A、MTP 基因的 CDS 区序列分别为 2313bp、2682bp。拼接序列包含部分 CPT1A5’UTR(131bp)和 3’UTR(146bp)，MTP 5’UTR(153bp)和 3’UTR(56bp)。

条干,基因,载体,干扰效率

图 2 鹅 CPT1ACDS 区序列拼接Fig.2 Coding sequenee assembly of goose MTP3.2 鹅 CPT1A、MTP 基因 miRNA 干扰载体构建及筛选3.2.1 干扰载体构建由北京百奥迈科生物科技有限公司构建鹅 CPT1A、MTP 基因干扰载体，选择了针对鹅 CPT1A、MTP 基因特异性的位点，每个基因设计了 3 条相应寡核苷酸序列，经 BLAST 检索不与鹅的其他任何基因存在同源序列。3.2.2 最佳干扰序列的筛选为筛选最佳干扰序列，采用脂质体转染法分别将这 6 条干扰载体转染肝细胞24h，用荧光定量检测 CPTlA、MTP 的 mRNA 表达量，结果发现 CPTlA 基因第条干扰载体可抑制 CPTlA 的表达，干扰效率达 51.3%；MTP 基第 2 条干扰载体可抑
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S835

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