猪瘟病毒强弱毒感染猪PBMCs转录组分析及HES4抗病毒分子机制研究

发布时间：2020-05-25 02:31

【摘要】：猪瘟(classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起猪的一种急性、烈性传染病。其病原CSFV,为黄病毒科瘟病毒属成员,是具有囊膜的单股、正链RNA病毒。CSFV具有高、中、低毒力毒株,不同毒力的毒株感染宿主后能够引起不同的临床症状及宿主反应。前期虽然有研究利用微阵列技术对CSFV感染的细胞进行分析,并将差异转录的基因分类,但是并未解析差异基因影响病毒复制的机制。因此,筛选CSFV强弱毒株诱导的差异转录宿主分子,鉴定其对CSFV复制的影响并阐明其发挥作用的分子机制,将为深入揭示CSFV的致病机制和宿主的抗病毒反应提供线索。本研究中,我们将11头8周龄SPF猪随机分为3组,分别经颈部肌肉注射10~4.5.5 TCID_(50)的CSFV强毒株(石门株)和弱毒株(C株),并以注射等体积的DMEM组作为阴性对照。在感染前、感染后不同时间点进行体温监测、临床评分、血液中病毒载量检测、细胞凋亡和细胞因子检测等试验,以此构建CSFV强弱毒株感染的SPF猪模型,并对CSFV强弱毒株引起猪只的宿主反应进行了系统地分析。CSFV石门株感染猪出现发热、临床症状及组织学病理学损伤等;C株接种后虽然猪只的血液和组织器官中都能够检测到低水平的病毒基因组,但是并未观察到任何临床症状和组织病理学变化,结果说明CSFV强弱毒株影响CSF的病程和强度,而不影响病毒的组织嗜性和分布。此外,CSFV强弱毒株感染诱导不同程度的淋巴细胞的凋亡、T淋巴细胞亚群分化以及血清中白细胞介素2(IL-2)、IL-4、IL-6和IL-10的变化。由此表明,CSFV强弱毒株引起宿主不同程度的免疫反应从而导致疾病不同的发生、发展和结局。进一步分离CSFV强弱毒株感染猪只的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)进行转录组测序,以筛选差异转录的宿主分子。结果显示:在病毒感染后3 d,发现转录水平发生2倍以上变化的基因共3,582个,其中上调的基因有3,205个,而下调的基因有377个;在病毒感染后5 d,转录水平变化2倍以上的基因共7,456个,其中上调的基因有83个,而下调的基因有7,373个;在显著富集的前30个信号通路中,与免疫和病毒感染相关的信号通路包括NF-κB、RIG-I样受体、Toll样受体和JAK-STAT信号通路。结合生物信息学分析,我们选择20个候选分子进行RNAi试验,验证这些宿主因子对CSFV石门株复制的影响,发现IL-10、VLDLR和USP18下调后能够显著抑制CSFV石门株的复制,而HES4(Hairy and enhancer of split4)、Stefin A1、CYSLTR2、LGASL1、IFIT1、ISG15、CASP1、MOV10、USP25、Trim5、DDX58和ISG20下调后能够明显促进CSFV的复制。宿主分子HES4属于碱性-螺旋-环-螺旋(basic-helix-loop-helix,bHLH)超家族中的转录抑制因子,该分子在强毒石门株感染组中上调表达,而在弱毒C株感染组中无明显变化,我们选择该分子进行深入研究。研究发现,与C株接种组不同的是,石门株感染猪只后能够促进各组织、器官和PBMCs中HES4的上调。在体外试验中,感染CSFV石门株后,同样能够上调表达猪肺泡巨噬细胞(PAM)中HES4的表达水平。为了进一步证明HES4在CSFV石门株感染过程中发挥的作用,我们利用慢病毒系统建立了稳定表达HES4的PAM细胞系,感染CSFV石门株,结果显示,过表达HES4显著抑制CSFV的复制;而利用特异的siRNA下调HES4蛋白的表达后能够显著促进病毒的复制,表明HES4能够负调控CSFV的感染。在HES4抗病毒机制方面,我们研究表明,过表达HES4不影响IFN-β和NF-κB信号通路的活化,而能够呈现剂量依赖性地抑制CSFV内部核糖体进入位点(IRES)介导的蛋白翻译效率。此外,我们利用生物素标记的IRES进行RNA pulldown试验,发现HES4能够与IRES结合;应用游离的IRES进行竞争性试验,发现其可有效地抑制这种结合,从而表明HES4与IRES的相互作用是特异性的。综上所述,HES4是CSFV强弱毒株诱导的差异转录宿主分子,该分子与CSFV IRES相互作用并抑制其活性以拮抗CSFV的复制。
【图文】：

模式图,基因组结构,模式图,单股

图1.1 我国CSFV基因型分布（引自Luo et al., 2014）。Fig. 1.1 Distribution of CSFV genotypes in China (From Luo et al., 2014).猪瘟病毒FV是有囊膜的单股正链RNA病毒，属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（PPletnev et al., 2011）。病毒形态呈圆形、有囊膜、直径约为40-60 nm，衣壳呈二有病毒单股正链RNA基因组。CSFV的基因组由5 非编码区（5 -noncoding region的开放阅读框（open reading frame, ORF）和3 -NCR组成。ORF编码一个大小为多聚蛋白，并且在病毒和宿主蛋白酶的作用下被切割成4个结构蛋白（C、Erns、结构蛋白（Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）（Lindenbach 2）。

模式图,单股,瘟病毒属,黄病毒科

中国农业科学院博士学位论文第一章引言4图1.1 我国CSFV基因型分布（引自Luo et al., 2014）。Fig. 1.1 Distribution of CSFV genotypes in China (From Luo et al., 2014).1.1.2 猪瘟病毒CSFV是有囊膜的单股正链RNA病毒，属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）成员（Pletnev et al., 2011）。病毒形态呈圆形、有囊膜、直径约为40-60 nm，，衣壳呈二十面体对称，内含有病毒单股正链RNA基因组。CSFV的基因组由5 非编码区（5 -noncoding region, 5 -NCR）、一个大的开放阅读框（open reading frame, ORF）和3 -NCR组成。ORF编码一个大小为3,898个氨基酸的多聚蛋白，并且在病毒和宿主蛋白酶的作用下被切割成4个结构蛋白（C、Erns、E1和E2）和8种非结构蛋白（Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）（Lindenbach et al., 2013）（图1.2）。图1.2 CSFV基因组结构及其编码蛋白模式图（引自Li et al., 2017）。Fig. 1.2 Organization of the CSFV genome and polyprotein processing (From Li et al., 2017)
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.28

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