家兔RERG、TGFBR1基因多态性与生长性状关联性分析及TGFBR1对骨骼肌卫星细胞生长的影响

发布时间：2017-03-26 00:06

  本文关键词：家兔RERG、TGFBR1基因多态性与生长性状关联性分析及TGFBR1对骨骼肌卫星细胞生长的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：Ras超家族是一类重要的功能蛋白,它们介导生长因子、细胞因子和多种细胞外信号的信息通路,对细胞生长、分化、存活、增殖等多种功能的调节发挥重要作用。Ras家族成员RERG (Ras-related, estrogen-regulated, growth-inhibitory)是GTP/GDP的分子开关和生长抑制活性基因；转化生长因子-β(transforming growth factor-β)是一组调节细胞生长和分化的超家族,TGF-βI型受体(transforming gowth faetor preeeptorl TGFβR1/TGFBR1)通过TGF-β/Smad信号通路在细胞生长中起负调控作用。本实验选取RERG和TGFBR1基因为生长候选基因,以伊拉兔、新西兰兔、艾哥肉兔和天府黑兔共计978个样本为试验材料,采用直接测序法寻找两个基因编码区的SNPs位点。通过HRM技术对两个基因候选SNPs位点进行基因分型,分析候选SNPs位点与家兔生长的相关性。随后,选取刚出生的新西兰兔仔兔为实验材料,使用酶消化法结合percoll非连续密度梯度离心法,分离、纯化家兔骨骼肌卫星细胞(Skeletal muscle satellite cells,SCs),采用siRNA介导的TGFBR1基因沉默表达,研究其对家兔SCs增殖的影响。主要结果如下：1.在RERG基因外显子5上检测到3个同义突变位点,分别是c.255 TA,c.264 GA,c.330 GA,三个SNPs位点完全连锁。选取c.330 GA位点采用HRM技术对423只家兔(天府黑兔183只,新西兰兔120只,艾哥肉兔65只,伊拉兔55只)进行基因型分型,并进行关联性分析。结果表明：RERG基因AA基因型84日龄体重和42-84日龄日增重显著高于AG基因型；新西兰兔AA基因型个体84日龄体重显著高于GG基因型个体；伊拉兔AA基因型个体42-84日龄平均日增重显著高于GG基因型。2.在TGFBR1基因外显子8上检测到一个SNP位点,C.1264CA,氨基酸密码子由CGG突变为AGG,属于同义突变,只检测到CC、CA两种基因型。采用HRM技术对555只家兔(天府黑兔206只,新西兰兔188只,艾哥肉兔161只)对c.1264位点进行基因分型,并进行关联性分析。结果表明：艾哥肉兔AA基因型个体56日龄体重显著高于AC基因型个体；天府黑兔和新西兰兔AA基因型个体70日龄体重显著高于AC基因型个体；三个品种家兔AA基因型个体84日龄和42-84日龄平均日增重都显著高于AC基因型。3.选取刚出生的新西兰白兔后腿肌组织分离、纯化得到的SCs,通过形态学观察和免疫组化检测Desmin标志蛋白,发现细胞中Desmin呈阳性表达。表明本试验所分离、纯化得到的细胞为家兔骨骼肌卫星细胞,且纯度满足后续试验要求。4.针对TGFBR1基因,设计三对特异的siRNA序列转染SCs,通过q-PCR检测TGFBR1基因nRNA的相对表达量,筛选最佳siRNA是si-TGFBR1-01,最佳转染浓度50nmol/L si-TGFBR1-01,转染细胞48 h后对靶基因的mRNA表达水平的抑制效率为87.61%。5.转染TGFBR1后TGFBR1基因nRNA表达量下调,同时TGF-β/Smad信号通路下游基因Smad3基因也有一定程度下调,作为TGFBR1基因的配体基因TGFB1基因mRNA表达量出现上调,MSTN基因mRNA表达量下调,表明TGFBR1基因通过TGF-β/Smad信号通路对骨骼肌细胞增殖相关基因起负调控作用。6.对数期的SCs细胞进行转染实验,检测在转染50nmol/L si-TGFBR1-0148h后对细胞增殖能力的影响。结果发现TGFBR1基因mRNA被抑制表达后,细胞增殖能力显著高于对照组(P0.05),说明TGFBR1对骨骼肌细胞的增殖起负调控作用。家兔RERG和TGFBR1基因CDS区的SNPs与生长速度显著相关,RERG和TGFBR1基因可作为影响家兔生长性状的重要候选基因。通过对TGFBR1基因的抑制表达,证明TGFBR1基因对骨骼肌细胞增殖起负调控作用,为进一步研究TGFBR1基因或者TGF-β/Smad信号通路对骨骼肌细胞生长发育的作用提供了理论依据。
【关键词】：家兔 RERG基因 TGFBR1基因 干扰 骨骼肌卫星细胞
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S829.1
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 1 文献综述13-25
• 1.1 我国家兔养殖现状概述13-14
• 1.2 四个家兔品种简介14-16
• 1.2.1 新西兰白兔14-15
• 1.2.2 天府黑兔15
• 1.2.3 伊拉配套系15-16
• 1.2.4 艾哥肉兔16
• 1.3 单核苷酸多态性16-17
• 1.3.1 简介16-17
• 1.3.2 SNP与家兔育种17
• 1.4 RERG基因17-18
• 1.5 TGFBR1基因18-22
• 1.5.1 TGF-β家族的概述18-19
• 1.5.2 TGF-β受体19-20
• 1.5.3 TGF-β/Smad信号通路20-22
• 1.5.4 TGFBR122
• 1.6 骨骼肌卫星细胞22-23
• 1.6.1 骨骼肌卫星细胞简介22-23
• 1.6.2 骨骼肌卫星细胞分化23
• 1.7 研究目的及主要内容23-25
• 1.7.1 本实验研究目的23-24
• 1.7.2 实验主要内容24-25
• 2 试验材料25-29
• 2.1 试验动物选择与组织采集25
• 2.2 主要设备及器材25-27
• 2.2.1 分子实验主要设备仪器25-26
• 2.2.2 细胞培养主要设备仪器26-27
• 2.3 相关试剂及配制27-29
• 2.3.1 分子实验主要试剂的配制27-28
• 2.3.2 细胞培养相关试剂及配制28-29
• 3 试验方法29-45
• 3.1 耳组织基因组DNA提取29-30
• 3.2 DNA浓度及纯度检测30-31
• 3.3 RERG和TGFBR1基因引物设计、PCR扩增和SNPs检测31-34
• 3.3.1 引物设计与合成31-32
• 3.3.2 常规PCR反应体系及条件32-33
• 3.3.3 直接测序和变异位点筛选33
• 3.3.4 HRM基因分型33-34
• 3.4 新西兰兔SCs分离、纯化、鉴定及培养34-38
• 3.4.1 兔SCs分离及纯化34-35
• 3.4.2 SCs的形态学鉴定35
• 3.4.3 SCs的免疫组化染色35-36
• 3.4.4 细胞传代36
• 3.4.5 冷冻与复苏36-37
• 3.4.6 诱导分化和HE染色37-38
• 3.5 siRNA合成及转染细胞38-39
• 3.5.1 siRNA的合成38
• 3.5.2 有效siRNA筛选38-39
• 3.5.3 siRNA转染浓度筛选39
• 3.6 细胞总RNA提取和检测39-41
• 3.6.1 细胞总RNA提取39-40
• 3.6.2 RNA检测40-41
• 3.7 细胞总RNA反转录为cDNA41-42
• 3.8 实时荧光定量PCR42
• 3.9 细胞增殖检测42-43
• 3.10 数据处理43-45
• 3.10.1 主要分子生物学软件43
• 3.10.2 多态信息与相关性统计分析43-44
• 3.10.3 qPCR组织表达研究统计分析44-45
• 4 试验结果45-63
• 4.1 四个家兔品种部分个体生长数据45-49
• 4.2 基因组DNA提取结果49
• 4.3 RERG基因遗传多态性及其与家兔生长性能的关联性分析49-54
• 4.3.1 RERG基因PCR扩增49-50
• 4.3.2 RERG基因PCR产物测序50-51
• 4.3.3 同义突变SNPs密码子偏好性分析51
• 4.3.4 RERG基因SNPs位点分型51-52
• 4.3.5 RERG基因c.330G>A位点遗传多态性52-53
• 4.3.6 RERG基因c.330G>A位点与家兔不同品种生长性状关联性分析53-54
• 4.4 TGFBR1基因遗传多态性及其与家兔生长性能的关联性分析54-58
• 4.4.1 TGFBR1基因PCR扩增54-55
• 4.4.2 TGFBR1基因PCR产物测序55
• 4.4.3 TGFBR1基因SNP位点分型55-56
• 4.4.4 TGFBR1基因c.1264 C>A位点遗传多态性56-57
• 4.4.5 TGFBR1基因c.1264 C>A位点与家兔不同品种生长性状关联性分析57-58
• 4.5 TGFBR1基因对家兔骨骼肌卫星细胞生长的影响58-63
• 4.5.1 SCs的形态学观察58-59
• 4.5.2 家兔SCs的免疫组化染色鉴定59-60
• 4.5.3 荧光鉴定siRNA转染效率60
• 4.5.4 细胞总RNA提取及反转录60-61
• 4.5.5 有效siRNA筛选61
• 4.5.6 si-TGFBR1-01干扰最佳浓度的筛选61-62
• 4.5.7 转染对TGF-β/Smad信号通路TGFB1、MSTN和Smad3基因表达的影响62-63
• 4.5.8 TGFBR1对骨骼肌卫星细胞生长的影响63
• 5 分析与讨论63-67
• 5.1 HRM分型技术63-64
• 5.2 同义突变的生物学意义64-65
• 5.3 RERG基因与家兔生长性状相关性65
• 5.4 TGFBR1基因与家兔生长性状相关性65-66
• 5.5 TGFBR1基因对家兔骨骼肌卫星细胞生长的影响66-67
• 6 结论67-68
• 参考文献68-74
• 致谢74

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