牦牛Cyclin D1、E1基因克隆及IGF-I、TGF-β1对Cyclin D1在睾丸支持细胞表达的影响

发布时间：2020-05-29 11:01

【摘要】：Cyclin D1和Cyclin E1均为细胞G1/S期关键蛋白。本研究旨在克隆牦牛(Bos grunniens)Cyclin D1和Cyclin E1基因的CDS序列,分析其生物学特性,并研究胰岛素样生长因子-I(Insulin-like growth factor-I,IGF-I)和转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)对Cyclin D1在睾丸支持细胞(Sertoli cell,SC)中表达的影响。采用RT-PCR技术克隆牦牛Cyclin D1和Cyclin E1基因,采用免疫荧光染色技术对其蛋白在SCs中的表达进行了定位分析。采用实时定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法检测不同浓度的IGF-I(0(对照组)、25、50、100、150 ng?m L~(-1))和不同时间(0(对照组)、5、12、18、24 h)、不同浓度(0、250、500、750、1000 pg?mL~(-1))的TGF-β1对Cyclin D1基因和蛋白表达的影响。结果如下:(1)牦牛Cyclin D1和Cyclin E1基因与其它物种的同源性均较高,GenBank登录号分别为KY 420723和KY437813。其蛋白在SCs胞核中均高表达,为核蛋白。(2)IGF-I浓度为25和150 ng?mL~(-1)作用组Cyclin D1 mRNA表达量与对照组(0 ng?m L~(-1))差异不显著(P0.05),50和100 ng?m L~(-1)作用组Cyclin D1 mRNA表达量显著高于其他各组(P0.05);100 ng?mL~(-1)作用组Cyclin D1蛋白表达量与对照组差异不显著(P0.05),25、50和150 ng?mL~(-1)作用组Cyclin D1蛋白表达量显著高于对照组(P0.05);IGF-I浓度为50 ng?m L~(-1)时,Cyclin D1 mRNA和蛋白表达量均为最高,分别为对照组的1.65和1.20倍。(3)TGF-β1作用于SCs 5、12和24 h时,Cyclin D1 mRNA的表达量显著高于对照组(P0.05),作用到18 h时,其表达量显著低于其它组(P0.05);不同时间处理组的Cyclin D1蛋白表达量都显著高于对照组(P0.05)。TGF-β1各浓度处理组中Cyclin D1 mRNA和蛋白表达量均显著高于对照组(P0.05)。TGF-β1以时间和剂量依赖的方式促进Cyclin D1的表达,最佳时间和浓度分别为12 h和750 pg?m L~(-1)。结果表明,Cyclin D1和Cyclin E1在进化过程中高度保守,其蛋白质定位于细胞核;IGF-I和TGF-β1可以通过促进Cyclin D1的表达来调控SCs的生长。本研究为调控SCs的发育提供了实验依据。
【图文】：

10]。若新生大鼠体内 FSH 的功能受到抑制，SCs 最终的数目只有对照图1 哺乳动物睾丸结构[1]Fig.1 The structure of mammalian testis[1]

2.2 CyclinD1、CyclinE1 基因 CDS 序列克隆及生物信息学分析Cyclin D1-C、Cyclin E1-C 进行 RT-PCR 扩增后，琼脂糖凝胶电泳显示，预期位置有明显荧光条带（图 2）。利用 NCBI 在线软件 BLAST 对拼接后的序列进图 1 细胞培养和鉴定（标尺 A~D：100 μm，，E：50μm）Fig.1 The cultivation and identification of the cells (Bar: A~D:100 μm,E:50μm)A. 原代 SCs； B. 三代 SCs；C. Fasl 阳性表达；D.阴性对照 E. Feulgen 染色A. The first generation of SCs；B. The third generation of SCs；C. Positive staining for Fasl；D. Negative control；E. Feulgen staining
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S823.85

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本文编号：2686831