载铜锌蒙脱石对断奶仔猪肠道微生态和屏障功能的影响及其机理探讨

发布时间：2020-05-29 12:05

【摘要】：本论文旨在研究载铜锌蒙脱石(Cu/Zn-Mt)对断奶仔猪肠道微生态和屏障功能的影响并探究其防治断奶仔猪应激性腹泻的可能作用机理。以蒙脱石为载体,负载铜锌制备了载铜锌蒙脱石(Cu/Zn-Mt),通过体外实验研究了 Cu/Zn-Mt对细菌活性、肠上皮屏障功能和炎症反应的影响;仔猪饲养实验研究了 Cu/Zn-Mt对断奶仔猪生长性能、腹泻、肠道微生态和屏障功能的影响,并使用16SrRNA高通量测序、转录组学、代谢组学等技术阐明其作用机制,为有效解决断奶仔猪腹泻问题提供科学依据。主要研究结果如下:1 Cu/Zn-Mt制备、表征、抗菌活性及细胞毒性研究本试验以蒙脱石为载体,负载抗菌金属离子(Cu2+/Zn2+)制备了一系列的改性蒙脱石:载铜蒙脱石(Cu-Mt),载锌蒙脱石(Zn-Mt),不同铜锌比例的载铜锌蒙脱石(Cu/Zn-Mtl、Cu/Zn-Mt2、Cu/Zn-Mt3)。通过X射线衍射、傅里叶变换红外光谱、透射电镜等方法对制得的改性蒙脱石进行结构表征,并测定了其表面积、抗菌活性及细胞毒性。结果表明:铜和锌主要是以水合阳离子的形式,以离子交换的方式进入蒙脱石晶格层间,还有少量的铜和锌以化学吸附的形式进入Si-O四面体和Al-O八面体的微孔中;改性蒙脱石仍为层状结构,为多层蒙脱石晶片组成。抗菌实验发现,与Cu-Mt,Zn-Mt相比,Cu/Zn-Mt提高了抗细菌活性,表现出协同抗菌效果,抗菌机理可能是由于铜锌之间的相互协同作用。3种不同铜锌负载比例的Cu/Zn-Mt中,Cu/Zn-Mt-1与Cu/Zn-Mt-2抗细菌活性效果最好。另外,以Cu/Zn-Mt-2为研究对象,发现其抗细菌活性与其粒径大小有关。粒径越小,比表面积越大,Cu/Zn-Mt-2抗菌活性效果越好。细胞毒性实验表明Cu/Zn-Mt-2对IPEC-J2细胞表现出较弱的毒性。本试验进一步利用转录组学、透射电镜、扫描电镜、DNA电泳等方法研究Cu/Zn-Mt处理对E.Coli活性的影响,以此来探明Cu/Zn-Mt抗菌机理。结果表明:1)Cu/Zn-Mt可通过铜锌离子和吸附E.Coli起到抗菌作用;2)Cu/Zn-Mt处理使细菌活性氧增加、细胞膜通透性增加、DNA降解、抑制生物膜形成;3)Cu/Zn-Mt处理可获得153个差异表达基因,其中上调基因133个,下调基因20个;GO功能注释显示差异基因主要与金属离子结合和跨膜转运,蛋白、酶、核酸等生物合成和代谢过程等相关;KEGG富集分析发现共有41个基因注释到7个代谢通路中,其中硫代谢、核酸降解、嘌呤代谢、核糖核酸聚合酶、氨基酸代谢合成等代谢通路显著富集;结果提示,以蒙脱石为载体,负载铜锌制备的Cu/Zn-Mt具有协同抗菌活性以及较弱的细胞毒性,通过干扰细菌酶、蛋白、核酸等生物合成和代谢过程,使细菌失去正常的功能,从而发挥较长的抗菌性能。2 Cu/Zn-Mt对E.Coli诱导的体外肠上皮屏障损伤的影响本试验利用猪肠上皮IPEC-J2细胞构建E.Coli诱导的体外肠上皮屏障损伤模型来研究Cu/Zn-Mt对E.Coli诱导的体外肠上皮屏障功能的影响。本实验分为2个部分:1:研究Cu/Zn-Mt预处理对E.Coli诱导的体外肠上皮屏障损伤的影响。2:Cu/Zn-Mt对E.Coli感染后体外肠上皮屏障的影响。实验一结果表明:1)与对照组相比,E.Coli感染IPEC-J2细胞显著增加了(P0.05)transwell细胞上室、下室培养基中E.Coli数量,降低了(P0.05)肠上皮细胞跨上皮电阻TER,增加了(P0.05)FD4通透性,引起紧密连接蛋白(Occludin、ZO-1、Claudin-1和Claudin-2)分布紊乱;Cu/Zn-Mt预处理显著降低了(P0.05)transwell细胞上室、下室培养基中E.Coli数量,缓解了E.Coli诱导的肠上皮屏障TER的下降和FD4通透性的升高(P0.05),显著抑制了紧密连接蛋白分布紊乱(P0.05)。实验二结果表明:E.Coli感染IPEC-J2细胞引起肠上皮屏障损伤,紧密连接蛋白分布紊乱,促炎细胞因子表达增加;在此基础上外源添加Cu/Zn-Mt可缓解E.Coli诱导的肠上皮屏障TER的下降和FD4通透性的升高(P0.05),显著抑制了紧密连接蛋白分布紊乱(P0.05)。另外,外源添加Cu/Zn-Mt还可降低(P0.05)促炎细胞因子(CXCL1、CXCL2、CXCL6、IL-6、IL-8、TNF-α)的表达。综上所述,Cu/Zn-Mt保护体外肠上皮细胞屏障的途径有两种:1,通过抑制E.Coli增殖从而减少E.Coli感染肠上皮细胞引起的损伤。2,Cu/Zn-Mt直接作用于肠上皮细胞,修复肠上皮细胞屏障的损伤。3 Cu/Zn-Mt对断奶仔猪生长性能,肠道菌群和肠屏障功能的影响本试验旨在研究日粮中添加Cu/Zn-Mt对断奶仔猪生长性能,肠道菌群和肠屏障功能的影响。选取72头21±1日龄,体重约为6.36kg的“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪,随机分为2处理组,每个处理6个重复,每个重复6头猪,饲养试验周期为14天。按日粮添加水平设:基础饲粮组(对照组)和基础日粮+2 g/kg Cu/Zn-Mt(Cu/Zn-Mt组)。结果表明:与对照组相比,Cu/Zn-Mt组显著增加了(P0.05)断奶仔猪平均日增重、饲料效率、空肠绒毛高度和隐窝深度比值、空肠微绒毛高度、肠黏膜紧密连接蛋白(Occludin,Claudin-1和ZO-1)、血清和回肠粘膜铜锌含量;Cu/Zn-Mt组空肠绒毛生长较茂密、排列规则、整齐均匀;Cu/Zn-Mt显著降低了(P0.05)腹泻指数,空肠荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖的通透性,空肠、结肠大肠杆菌和链球菌的数量。Cu/Zn-Mt组对粪便铜锌含量、菌群耐药基因、耐铜/锌基因表达无影响(P0.05);结果提示,日粮中添加Cu/Zn-Mt可以提高断奶仔猪的生长性能,增加断奶仔猪血清、回肠粘膜铜锌含量,降低腹泻率,抑制肠道中有害菌的增殖,改善肠道黏膜屏障,且不会诱导耐药细菌和抗铜锌细菌增加。4基于16sRNA测序技术和代谢组学技术研究Cu/Zn-Mt对断奶仔猪肠道微生态的影响本试验以16sRNA测序和代谢组学为技术手段,研究日粮中添加Cu/Zn-Mt对肠道菌群结构及代谢的影响。结果显示:16sRNA测序显示,与对照组相比,日粮中添加Cu/Zn-Mt显著改变了肠道菌群结构,降低了结肠菌群中potential pathogenic菌的比例,增加了 stress tolerence菌的比例。在门水平上,Cu/Zn-Mt组显著增加了Firmicutes相对丰度,降低了(P0.05)Bacteroidetes、Proteobacteria相对丰度。在属水平上,与对照组相比,Cu/ZnMt组显著增加了(P0.05)Coprococcus、Lactobacillus、Eubacterium、Akkermansia、f_Lachnospiraceae、Bifidobacterium、Roseburia、Faecalibacterium、Enterococcus相对丰度,降低了(P0.05)Clostridium、f_Erysipelotrichaceae、Turicibacter、Streptococcus、Prevotella、f_Enterobacteriaceae相对丰度。KEGG代谢通路分析结果显示Cu/Zn-Mt处理显著增加了(P.05)肠道菌群代谢功能在金属离子吸收代谢、氨基酸代谢、抗感染能力等代谢途径富集,减少了(P0.05)相关炎症信号通路、脂多糖生物合成、凋亡、细菌入侵肠上皮等代谢通路富集。代谢组学数据显示,与对照组相比,Cu/Zn-Mt组发生显著性变化的结肠差异代谢产物有19种(P0.05),差异代谢产物主要涉及丁酸盐代谢、氨基酸代谢(谷氨酸、精氨酸、脯氨酸、组氨酸等)、脂肪代谢(胆汁酸合成、肉碱合成、脂肪酸代谢、花生四烯酸代谢、亚麻酸和亚油酸代谢、短链饱和脂肪酸的线粒体-氧化作用)、嘌呤代谢、尿素循环、糖代谢(丙酮酸代谢)、维生素代谢(烟酸和烟酰胺代谢)、类固醇生成。结果提示,日粮中添加Cu/Zn-Mt可改善肠道菌群结构及代谢功能。5 Cu/Zn-Mt对LPS诱导的断奶仔猪肠道屏障损伤模型的影响本试验利用LPS诱导断奶仔猪肠道屏障损伤模型,旨在研究Cu/Zn-Mt对肠上皮屏障损伤的影响,探索Cu/Zn-Mt保护屏障的分子信号机制。试验选取18只21±1日龄断奶仔猪随机分为三组,每组6只。对照组和LPS组饲喂基础日粮,LPS+Cu/Zn-Mt组饲喂基础日粮+2g/kg Cu/Zn-Mt。饲喂14天后,LPS组和LPS+Cu/Zn-Mt组腹腔注射大肠杆菌LPS,注射剂量为100 μg/kg体重,对照组腹腔注射相同量的0.9%氯化钠溶液。注射4h后取样分析。结果表明,与对照相比,LPS组处理显著降低了肠道TER、紧密连接蛋白,增加了 FD4通透性,促炎细胞因子mRNA表达,表明LPS诱导仔猪肠屏障损伤。与LPS组相比,日粮中添加Cu/Zn-Mt显著增加了(P0.05)空肠TER,紧密连接蛋白的表达,降低了 FD4通透性,促炎细胞因子(TNF-α IL-1β、IL-6、IFN-γ和 IL-8)的mRNA表达。转录组数据显示,与LPS组相比,日粮中添加Cu/Zn-Mt可上调(P0.05)细胞核和细胞外泌体中的差异表达基因,影响炎症反应、免疫反应等相关生物过程,减轻肠道炎症反应,具体作用机制可能与影响Toll样受体信号通路、MAPK信号通路、细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路、转录因子活性、NF-kB信号通路等代谢通路有关。结果提示:日粮中添加Cu/Zn-Mt可通过减轻肠道炎症,从而缓解LPS诱导的肠道屏障损伤。综上所述,本试验以蒙脱石为载体制备的Cu/Zn-Mt具有较强的抗菌能力,同时具有修复受损的上皮屏障功能,缓解E.Coli引起的炎症反应。日粮添加Cu/Zn-Mt可改善断奶仔猪生长性能,降低断奶仔猪腹泻,缓解断奶应激。其缓解断奶应激的作用机制可能与改善肠道微生态,缓解肠道炎症,从而保护断奶仔猪肠上皮屏障功能有关。
【图文】：

示意图,示意图,蒙脱石,单元层

石是膨润土的主要成分，其在中国矿产资源丰富，有４００多处矿点分布于２３个逡逑省区（辽宁、黑龙江、吉林、河北、河南、浙江等），已探明储量位居世界第一。逡逑如图１．１所示，蒙脱石是一种层状结构、片状结晶的颗粒极细的含水硅铝酸逡逑盐，基础结构单元由两层硅氧（Ｓｉ－Ｏ）四面体，中间夹着铝氧（Ａ１－０）八面体交替逡逑排列的２：１层状结构，，属于典型的２：１型“三明治”结构，层厚约为ｌｎｍ，长宽逡逑约为ｌＯＯｎｍ６６。单元层之间的空间被称为“层间域”或“层间”。理论上，蒙脱逡逑石的组成成分为Ｓｉ０２邋（６６．７％）邋，邋Ａｌ２0３邋（２８．３％）邋，邋Ｈ２０邋（５％）邋６７。但由于矿物逡逑共生组合不同，实际上蒙脱石层间还含有少量的ＭｇＯ、ＣａＯ、Ｎａ２０、Ｆｅ２０３等组逡逑分。蒙脱土具有带电荷性、亲水性、膨胀性、分散悬浮性、吸附性、较大的比表逡逑面积、阳离子交换能力、粘附能力等重要物理化学特性。逡逑比表面积大蒙脱石颗粒细小（粒径小于２邋ｐｍ），通常以数以千计的结果单元逡逑层堆砌而成，比表面积大，同时具有巨大的表面能６８。以粒径２邋ｐｍ算，每个钠逡逑基蒙脱石颗粒可由１３００多个蒙脱石结构单元层高度的片体组成。逡逑带负电荷６９蒙脱石Ｓｉ－０四面体片中的少量Ｓｉ４＋会被Ｆｅ３＋、Ａｌ３＋等低价离子逡逑取代

衍射图,衍射图,层间距,离子

３．１．１改性Ｍｔ结构表征分析逡逑ＸＲＤ射线结果表明了邋Ｃｕ／Ｚｎ离子可插层进入Ｍｔ层间。改性Ｍｔ的层间间距逡逑ｄ（＿如图２．１所示。Ｎａ－Ｍｔ衍射峰的（１＿）值为１．５３４ｎｍ。改性蒙脱石中，Ｃｕ－Ｍｔ、逡逑Ｚｎ－Ｍｔ、Ｃｕ／Ｚｎ＿Ｍｔ－ｌ、Ｃｕ／Ｚｎ－Ｍｔ－２邋和邋Ｃｕ／Ｚｎ－Ｍｔ－３邋的邋ｃＷｈ）分别为邋１．６５４ｎｍ、１．６３８逡逑ｎｍ、１．６４９邋ｎｍ、１．６４１邋ｎｍ、１．６４５邋ｎｍ。虽然邋Ｃｕ／Ｚｎ邋离子半径分别为邋０．０７２邋ｒａｎ、０．０７４逡逑ｎｍ，小于钠离子半径０．０９５邋ｎｍ，但改性Ｍｔ的层间距明显大于Ｎａ－Ｍｔ的层间距。逡逑Ｃｕ／Ｚｎ离子可能以水和阳离子的形式插层进入Ｍｔ。已有研究报道Ｃｕ／Ｚｎ离子分逡逑别以［Ｚｎ（Ｈ２０）６］２＋邋／邋［Ｃｕ（Ｈ２０）６］２＋的形式与Ｍｔ层间钠离子进行交换。另外，各种改逡逑性Ｍｔ层间距ｃＷｍ差异不大，可能与Ｃｕ离子和Ｚｎ离子的半径大小相差不大有逡逑关。逡逑Ｉ邋．１．６４３ｎｍ逡逑＼Ｊ＼逦ｉ逦Ｃｕ／Ｚｎ－Ｍｔ－３逡逑一逦人逦一逡逑．ｍ邋１．６４０ｎｍ逡逑？，壚逡逑＼Ｊ＼＾＾逦Ｃ＾Ｚｎ－ＭＭ逡逑１邋Ａｌ．６３４ｎｍ逡逑‘逦复邋Ｚｎ－Ｍｔ逡逑Ｉ邋ｉｌ邋１．６５４ｎｍ逡逑＾＾－久逦Ｃｕ￣Ｍｔ逡逑＼邋ｌ＼邋１．５３４ｎｍ逡逑ＶＶ．逦，逦＞邋Ｎａ－Ｍｔ逡逑Ｉ逦１逦Ｉ逦＇逦Ｉ逦？逦Ｉ逦１逦Ｉ逡逑０逦２０逦４０逦６０逦８０逡逑２０（°）逡逑图２．１改性Ｍｔ的ＸＲＤ衍射图逡逑Ｆｉｇ邋２．１邋ＸＲＤ邋ｐａｔｔｅｒｎｓ邋ｏｆ邋ｍｏｄｉｆｉｅｄ邋Ｍｔ逡逑３２逡逑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S828.5

【参考文献】