单增李斯特菌氨基肽酶Lmo1711以及鞭毛结构蛋白FlhB的生物学功能研究

发布时间：2020-05-29 16:34

【摘要】：单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)为革兰氏阳性菌胞内寄生菌,广泛存在于生鲜食品和环境中。单增李斯特菌可穿过肠屏障,通过血流传播并到达肝脏,脾脏,中枢神经系统和胎儿,最终引起人败血症、脑炎、脑膜炎和胃肠炎及孕妇流产,死亡率可达30%,是最严重的人类食源性感染之一。单增李斯特菌在感染过程中,需要表达多种毒力蛋白来完成对宿主细胞的感染。单增李斯特菌将毒力因子分泌到胞外,需要不同的分泌系统参与,目前已知主要是Sec分泌系统和Tat分泌系统承担分泌功能,而鞭毛分泌系统是否也参与了特殊因子的分泌目前还未有报道。因此,本研究主要阐明了:1.单增李斯特菌氨基肽酶Lmo1711的体外酶学功能及其在细菌感染过程中的生物学作用。2.单增李斯特菌鞭毛结构元件FlhB的生物学功能。1.单增李斯特菌氨基肽酶Lmo1711的酶学特征与参与细菌感染我们通过生物信息学分析预测Lmo1711属于氨基肽酶M29家族,氨基肽酶II型,可以水解氨基酸N端残基对蛋白进行修饰。酶活分析显示,Lmo1711具有较强的氨基肽酶活性,针对不同底物的结合和催化能力差异较大。在单肽对硝基苯胺底物中,Lmo1711与亮氨酸对硝基苯胺(Leu-pNA)、精氨酸对硝基苯胺(Arg-pNA)和赖氨酸对硝基苯胺(Lys-pNA)反应对应的K_(cat)/K_m分别为3.149×10~5min~(-1)M~(-1)、1.536×10~5min~(-1)M~(-1)和1.035×10~4min~(-1)M~(-1),由此可见Lmo1711对Leu-pNA的催化效率最高,即对亮氨酸残基的亲和程度最高;对多肽对硝基苯胺切割能力较弱。Lmo1711氨基肽酶活性具有金属离子依赖性,Co~(2+)、Cd~(2+)、Zn~(2+)等多种金属离子均能显著增强其活性,其中Co~(2+)的激活效应最显著。酶学分析表明,Lmo1711保守的关键氨基酸活性位点(Glu250、Glu316、His345、Tyr352、His378、Asp380)决定了Lmo1711的催化活性。生物学功能研究发现,缺失lmo1711后细菌生长能力不受影响,但缺失株感染Caco-2细胞后其侵袭和增殖能力显著低于野生株。此外,缺失该基因后细菌在L929细胞中的迁移能力亦显著降低。本研究首次发现并证实,单增李斯特菌Lmo1711属于M29氨基肽酶家族成员,具有较强的催化活性,且对金属离子具有不同程度的依赖性,并且在一定程度上参与了细菌在细胞中的感染。2.单增李斯特菌鞭毛结构元件FlhB生物学功能研究本研究发现单增李斯特菌鞭毛结构蛋白FlhB(由lmo0679基因编码)参与了细菌的鞭毛合成与运动。缺失flhB后李斯特菌不形成鞭毛,运动能力完全丧失,并导致motA、flaA、fliN、fliI、fliK、flgC等多种鞭毛相关基因的转录水平和FliM、Fli Y和Fla A等鞭毛蛋白的表达水平降低。基于细菌鞭毛与III型分泌系统的亲缘性,本研究以单增李斯特菌鞭毛结构元件FlhB为主要研究对象,进一步探索了李斯特菌鞭毛结构与蛋白分泌功能之间的关联。我们利用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,i TRAQ)方法分别对flhB和fliS的基因缺失株中分泌蛋白进行了差异蛋白质谱分析。iTRAQ结果显示,李斯特菌缺失flhB和fliS后大量的鞭毛与非鞭毛相关蛋白分泌量下降。具体来看,在37℃条件下,缺失flhB后有38种蛋白分泌量上调,39种蛋白分泌量下调;缺失fliS后有25种蛋白分泌量上调,25种蛋白分泌量下调。在30℃条件下,缺失flhB后有29种蛋白分泌量上调,62种蛋白分泌量下调;缺失fliS后有23种蛋白分泌量上调,57种蛋白分泌量下调。可以看出,在30℃条件下,flhB和fliS缺失后下调的蛋白数量明显多于在37℃。COG(Cluster of orthologous group)功能分类显示,这些差异蛋白主要参与翻译,核糖体结构与生物发生以及糖转运与代谢等过程;GO(Gene ontology)分析鉴定发现,差异蛋白主要是细胞组分(27.74%),巨分子复合物(12.19%)和细胞器(12.01%)。经过查询Uniprot等蛋白信息网站与相关文献,我们从中选取了鞭毛钩调节蛋白FliK、鞭毛丝组件蛋白FlaA和细胞分裂调控蛋白DivIVA等李斯特菌中报道较少的蛋白进行Western blot验证。WB结果显示,在30℃条件下,flhB缺失后,DivIVA,FliK和FlaA分泌量显著下降;fliS缺失后Fli K和FlaA分泌量显著下降。其中DivIVA与细菌的分裂增殖相关。本研究首次发现并证实单增李斯特菌FlhB参与了细菌运动,鞭毛合成,鞭毛与非鞭毛蛋白分泌等过程,为进一步探索单增李斯特的非经典分泌机制与致病机制提供了初步试验基础。综上,本研究:(1)首次探索并证实了单增李斯特菌氨基肽酶Lmo1711属于金属离子依赖的M29氨基肽酶家族成员,并参与了细菌在细胞中的感染和迁移,与细菌毒力相关。研究结果对于深入完善和挖掘李斯特菌新的毒力因子及致病机制具有重要意义。(2)首次探索了单增李斯特菌鞭毛结构元件FlhB的生物学功能和介导的分泌作用,为后续进一步研究革兰氏阳性菌鞭毛T3SS及新的分泌型蛋白的生物学功能奠定了关键基础。
【图文】：

美国,吞噬体,内化,宿主细胞

2 单增李斯特菌感染机制单增李斯特菌是典型的胞内寄生菌，能够感染人和动物消化道黏膜细胞并定植，进而侵染宿主细胞。首先是黏附与侵袭细胞的过程；单增李斯特菌游动到达细胞表面后，表达黏附和侵袭相关因子[8]，主要是内化素 A（InlA）[9]和内化素 B（InlB）分别与宿主细胞表面受体蛋 E-钙黏蛋白（E-cadherin）和肝细胞生长因子（Met）结合[10]，进而通过胞吞作用进入细胞。其次是逃离吞噬体的过程，菌体进入细胞之后被脂质膜包裹形成吞噬体，细菌此时表达溶血素 LLO[11]和磷脂酶 PlcA、PlcB，随后在 LLO、PlcA 和 PlcB 等共同作用下吞噬体被溶解[12, 13]，，图 1.2016 年 8 月至 2017 年 3 月，美国发生了 8 例李斯特菌病，其中 2 人死亡Figure 1. From August 2016 to March 2017, 8 cases of listeriosis occurred in the UnitedStates, including 2 deaths

生命周期,氨基肽酶,多肽和蛋白质,毒力因子

氨基肽酶概述氨基肽酶作为一种水解酶，可能参与单增李斯特菌毒力因子修饰，进而与感染过程存在某种关联。氨基肽酶是针对寡肽、多肽和蛋白质水解 N 末端残基的酶[16]，不仅能够完全降解蛋白质和多肽，使得组分氨基酸被重新利且用于蛋白质翻译后加工，使得蛋白质在到达正确的空间位置或处于必需的发育环境前无法被激活[17]。绝大部分氨基肽酶都具有金属离子依赖性，其基列存在 H-E-X-X-H（His-Glu-X-X-His）活性位点序列对于催化和配位金属是必需的。金属蛋白酶活性由一个或两个二价离子（通常是锌）介导，这些激活水分子以进行底物肽键的亲核攻击，进而起到降解、加工、抑制等作用[属蛋白酶对机体也具有多样性的功能，例如基质金属蛋白酶（MMPs）是参图 2. 单增李斯特菌胞内生命周期[1]Figure 2 Intracellular life cycle of Listeria. monocytogenes[1]
【学位授予单位】：浙江农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.61

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