大肠杆菌DH5α规模化生产禽流感DNA疫苗的工艺及免疫应用研究

发布时间：2020-06-04 10:14

【摘要】：禽流感是由A型流感病毒引起的急性传染病,主要侵害禽类的呼吸和神经系统。在我国主要存在LPAI和HPAI两种类型的禽流感病毒,禽流感病毒毒株的不同亚型同时存在也是普遍现象。HPAI占我国禽流感发生次数的90%以上,在东中西部很多地区均有爆发且发病率、死亡率均比较高,致死率高达70%以上,对我国养殖业造成了非常大的经济损失。目前该病主要靠灭活疫苗接种来预防控制,在我国对HPAI农业部采取强制免疫。由于禽流感病毒基因突变率很高,尤其主要保护性抗原的HA基因突变非常频繁,使得H5亚型高致病性禽流感病毒出现了很多不同的病毒株,但是疫苗毒株相对滞后,同时灭活疫苗存在免疫剂量大、免疫副反应强、干扰流行病学检测等诸多缺点。禽流感DNA疫苗在激活体液免疫的同时也能诱发细胞免疫,而且免疫副反应小,不涉及病毒扩散等优点,其有望成为灭活疫苗的替代产品,国外已经有禽流感的商品化核酸疫苗,禽流感H5亚型DH5α-pCAGGoptiHA5 DNA疫苗新兽药核发已通过。重组菌的小规模培养和质粒小量提取技术,在实验室已经是非常成熟的技术,但是要规模化应用于兽用疫苗生产有较大困难,获得规模化高效表达和高效率提纯是当前主要瓶颈,DNA疫苗生产工艺优化是当前迫切需要。本研究摸索了在100L发酵罐中培养基筛选并建立了种子库,优化了DH5α-pCAGGoptiHA5规模化培养的参数条件,并进一步对放大至1000L发酵罐中禽流感DNA生产工艺进行了更为详细的参数研究。此外,对生产的DNA疫苗进行了免疫研究,探索DNA疫苗联合应用的可能性,为其它产品工艺和产品应用提供有效参考。结合统计学方法、响应面法、最陡爬坡法对DH5α-pCAGGoptiHA5培养工艺的各因素优化研究,筛选出培养基优化配方:胰蛋白胨(10g/L),蔗糖(17.5g/L),酵母粉(7.5g/L),硫酸铵(7.5g/L),NaCl(10g/L),利用100L反应器发酵培养,最终质粒浓度为115.25mg/L,产量提高88.52%。菌株经连续传15代后,通过菌培养特性和质粒遗传稳定性筛选,得到适应性良好的菌株15株,成功建立了菌种库,该菌株质粒非常稳定,且纯净性较好。通过规模化生产后,该菌种的质粒稳定性也非常好。通过对生产过程中主要影响因素进行优化实验,利用1000L发酵罐,成功进行了规模化放大生产。结果显示在接种量8%、溶氧30%的补料发酵,37.0℃转42.0℃温度诱导5h,质粒产量高达359.2mg/L,产量提高108.9%,具有可重复性,为规模化生产提供有效数据。利用改进的裂解提取法,采用自主研发的裂解仪、絮状物去除仪、切向流过滤组合工艺,使裂解效率提高15倍,质粒回收效率提高了18.74%,质粒纯度良好。利用质粒制备的禽流感DNA疫苗进行了免疫实验,20μg质粒免后5周抗体即可达到7.3log2;200μg质粒大剂量进行免疫后观察14天,鸡只状态良好,无不良反应;30μg质粒剂量进行免疫两次,连续监测6个月,抗体效价平均为5.4log2。通过禽流感DNA疫苗和转移因子联合免疫研究摸索,结果表明二者联合免疫能提高禽流感抗体水平1.2个滴度,为禽流感DNA疫苗的临床推广应用提供参考。
【图文】：

流感病毒,形态结构,粒子,囊膜

图 1.1 流感病毒粒子的形态结构Fig.1.1 Particle structure of influenza virusB1、PB2、PA、HA、NA、NP 和 M1、M2 为结构蛋白，NS1、NS白。AIV 基因组 RNA 的复制和 AIV mRNA 转录的关键组分是由 PB2 三个亚基所构成的复合酶的聚合体所调控的，因为它的保守异率又比较低，把该部位作为重点靶位已变为抗 AIV 药物设计的。IV 粒子(图 1.1) 的表面纤突是在囊膜下分布着，形态不一，在囊 HA 蛋白和 NA 蛋白两种类型的表层纤突 (图 1.1)，长为 10-14n棒状，能凝集血红细胞，NA 形状像蘑菇样。每个病毒粒子表面突起，都由 NA 和 HA 共同构成，并且彼此均匀地在囊膜上分布[IV 粒子囊膜上还有一纤细的突起被称作 M2 跨膜蛋白，M2 可以

分布图,分布图,亚型,疫情报告

据相关报道统计仅 2017 年第 1 季度全球就共计报告发生 1444 起 HPAI情，其中包含 740 多万羽的易感禽，发病禽约 49 万羽，病死禽 34 万羽，禽近 680 万羽，，其中我国发病禽约 16 万羽，销毁禽约 113 万羽，造成了巨经济损失[64]。根据国际兽医局（OIE）编写的 2017 第 1 季度 HPAI 疫情报告来看，当 AIV 流行毒株比较复杂，所含有的 HPAI 病毒包括 H5N1、H5N2、H5N55N6、H5N8 和 H7N9 等 6 个亚型，其中以 H5N8 亚型最多，报告有 1258 起[62017 年从 OIE 网站(http://www.oie.int)查询 2013 年至今世界范围内 HPH5 和 H7 型）发病分布情况，不难看出我国自 2013 年 HPAI（H5 和 H7 型以前的局部的点发变为实时性的发生（图 1.2-图 1.7）。随着在检测中情流毒的不断变异，多地报道禽流感病毒感人的事件增加，就意味我国 HPAI的复杂性和控制难度更进一步。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.4

【参考文献】