气肿疽梭菌NanA基因真核表达载体的构建及小鼠免疫初探

发布时间：2020-06-07 10:58

【摘要】：气肿疽(Clostridium chauvoei)是一种急性、热性、败血性传染病,主要感染反刍动物,其典型症状为发病动物肌肉丰满部位发生炎性、气性肿胀,触压有捻发音,患部皮肤干硬易形成坏疽,食欲减退,呼吸困难。该病的流行有一定的地域性和季节性,在天气炎热的多雨季节多发生于潮湿的山谷、牧场。近年来常有爆发气肿疽的报道,为畜牧业和养殖业的发展带来了巨大的冲击,同时也逐渐地威胁到人类的健康和经济。为了制备安全有效的气肿疽核酸疫苗,有效控制该病的发生,本研究根据GenBank中已发表的气肿疽梭菌NanA基因序列,设计合成了一对特异性引物,以气肿疽梭菌总DNA为模板,扩增出NanA目的基因并克隆至pMD 18-T simple载体,对测序正确的NanA基因进行分析。将克隆质粒pMD 18-T-NanA进行双酶切后,与pVAX1真核表达载体连接,成功构建p VAX 1-NanA真核表达重组质粒并将其转染至Vero细胞,通过间接免疫荧光鉴定其表达。将成功构建的pVAX1-NanA质粒大量提取后免疫BALB/c小鼠,设置pVAX1-NanA核酸疫苗组、pVAX1空载体组和PBS对照组。对小鼠进行采血并分离血清,通过ELISA法测定血清中的IgG,IgG1、IgG2a抗体水平和IFN-y、IL-4细胞因子水平。第三次免疫2周后,通过流式细胞仪测定小鼠脾脏淋巴细胞中的CD4+和CD8+水平。通过对小鼠的抗体水平、细胞因子水平和T细胞亚群含量检测,综合评价小鼠的体液免疫和细胞免疫水平。研究结果表明:本试验成功扩增了气肿疽梭菌NanA基因,片段大小为1950bp,与参考序列相比,共存在3处核苷酸突变,核苷酸与氨基酸序列的同源性均为99.8%。该蛋白三级结构以β-折叠和无规则卷曲为主,蛋白表面有多个抗原表位区域。pVAX1-NanA核酸疫苗接种BALB/c小鼠后,其血清中IgG、IgG1和IgG2a的抗体水平显著高于pVAX1空载体组和PBS对照组(P0.05);IFN-γ和IL-4细胞因子水平极显著高于pVAX1空载体组和PBS对照组(P0.01)。淋巴细胞亚群CD4+、CD8+分析表明,pVAX1-NanA核酸疫苗免疫组的CD4+和CD8+水平显著高于 pVAX1 组和 PBS 对照组(P0.05),pVAX1-NanA极酸疫苗组的CD4+ 和 CD8+ 比值高于 pVAX1 空载体组与 PBS对照组,pVAX1空载体组和PBS对照组之间无显著差异。本试验为NanA蛋白功能的深入研究提供了参考,为气肿疽梭菌 NanA基因核酸疫苗的研发奠定了一定的基础。
【图文】：

平板培养,白色沉淀,硕士学位,镜检

延边大学硕士学位论义－结果结果逡逑平板培养及镜检结果逡逑肉汤中形成卜．清清朗、底部松散的白色沉淀，将试管竖立端涌起，伴打恶臭味。涂片镜检可见革兰氏ｍ件、两端钝呈单个存在，也坷见两个相连见图２。在血平板上生长出，，有微弱的ｐ溶血见图３。逡逑

血琼脂,菌落,培养基,平板培养

延边大学硕士学位论义－结果结果逡逑平板培养及镜检结果逡逑肉汤中形成卜．清清朗、底部松散的白色沉淀，将试管竖立端涌起，伴打恶臭味。涂片镜检可见革兰氏ｍ件、两端钝呈单个存在，也坷见两个相连见图２。在血平板上生长出，有微弱的ｐ溶血见图３。逡逑
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.61

【参考文献】