缺氧对山羊胎盘滋养层细胞生物钟和内质网应激信号通路的影响
发布时间：2020-06-07 15:14
【摘要】：胎盘滋养层细胞在胚胎着床和妊娠建立过程中起着至关重要的作用。已有研究表明生理或病理性缺氧从多种层面影响胎盘滋养层细胞的生理功能。但目前缺氧对胎盘滋养层细胞生理功能的调控机制尚不清楚。本研究基于“缺氧通过对山羊胎盘滋养层细胞(GTC)生物钟及内质网应激产生影响从而调控其生理功能”这一科学假说,通过CoCl_2和dimethyloxalylglycine(DMOG)建立GTC缺氧模型,运用real time PCR(qPCR)、实时生物荧光素酶测定系统(Kronos Dio AB-2550)和Western blotting等方法检测缺氧对GTC生物钟、内质网应激信号通路及类固醇合成基因表达的影响。主要结果如下:1.用CCK-8试剂盒分别检测不同浓度(0μM,100μM,200μM,400μM)的CoCl_2处理GTC在不同时间点(12 h、24 h和36 h)的细胞活力,结果表明200μM的CoCl_2是对GTC无明显细胞毒性的最大浓度。查阅文献并经验证500μM的DMOG为诱导GTC缺氧的适宜浓度。GTC经100 nM地塞米松(DXM)同步化处理2 h后,分别用200μM的CoCl_2和500μM的DMOG处理细胞,收集处理后不同时间点(12 h、16 h、20 h、24 h、28 h和32 h)的细胞样品,qPCR方法检测缺氧诱导因子HIF1α蛋白的靶基因Glut1和Vegfα的表达情况,运用双因素方差检验(Two way ANOVA)进行统计学分析。结果显示,GTC经CoCl_2处理后Glut1 mRNA的表达与对照组相比明显上升(P0.001),而Vegfα的表达与对照组相比无明显差异(P0.05)。GTC经DMOG处理后Glut1与VegfαmRNA的表达与对照组相比均明显上升(P0.001)。上述结果表明,GTC的缺氧模型成功构建。2.运用慢病毒技术将重组慢病毒载体pLV6-Bmal1-Luc转染GTC。细胞经100 nM DXM同步化处理2 h后,分为2组,一组用500μM的DMOG处理,一组用相同体积的DMSO处理,Kronos Dio AB-2550系统实时检测Bmal1启动子调控下的荧光素酶Luc活性的变化情况。结果显示,Bmal1-Luc在DMSO和DMOG处理组中呈现明显的节律性振荡,同时DMOG处理后,Bmal1-Luc周期明显增加(P0.001),振幅显著下降(P0.001),间接表明缺氧对GTC的生物钟系统具有显著的影响。3.qPCR方法检测200μM的CoCl_2和500μM的DMOG分别处理后不同时间点GTC核心生物钟基因的表达情况。运用Cosinor方法进行基因表达节律性分析,Two way ANOVA进行不同处理造成的差异性分析。结果显示:(1)正常情况下,GTC的核心生物钟基因(Bmal1、Dbp、Cry2和Per1)均呈现明显的节律性表达(P0.05)。(2)GTC经200μM的CoCl_2处理后其核心生物钟基因Bmal1和Cry2表达明显降低(P0.05),Per1的表达明显升高(P0.001),而Dbp的表达无显著变化(P0.05);同时Dbp和Cry2的表达节律性消失(P0.05),而Bmal1和Per1仍呈现节律性表达(P0.05)。(3)GTC经500μM的DMOG处理后其核心生物钟基因Bmal1表达明显降低(P0.001),Per1的表达明显升高(P0.001),而Dbp和Cry2的表达无显著变化(P0.05);同时DMOG处理后Bmal1、Dbp、Per1和Cry2仍呈现节律性表达(P0.001)。上述结果表明缺氧对GTC的生物钟具有显著的影响,但可能由于CoCl_2和DMOG诱导细胞缺氧的机制不同,其引起的变化也并不完全一致。4.运用Western bloting检测200μM CoCl_2处理后GTC在特定时间点12 h和32 h内质网应激信号通路相关蛋白的表达情况。结果显示,CoCl_2诱导的GTC缺氧会使内质网应激信号通路发生改变,主要表现为GRP78和ATF6蛋白水平的升高(P0.05),phospho IRE1a蛋白水平的降低(P0.05)。5.qPCR分别检测200μM的CoCl_2和500μM的DMOG处理后GTC在不同时间点其类固醇合成关键基因的表达情况,结果显示CoCl_2诱导GTC缺氧后其类固醇激素合成相关基因Star表达显著降低(P0.001);同时,DMOG诱导GTC缺氧后其类固醇激素合成相关基因Star表达水平无显著差异(P0.05),而Hsd3β表达水平显著降低(P0.001),提示缺氧刺激可能通过生物钟和内质网应激信号通路对GTC类固醇激素的合成产生重要影响。综上所述,CoCl_2和DMOG能够诱导GTC缺氧,从而引起GTC生物钟核心基因表达水平与节律的改变,同时引起GTC内质网应激信号通路相关蛋白和类固醇激素合成相关基因表达水平的改变。
【图文】：
第一章 缺氧调控细胞生物钟和内质网应激信号通路的研究进展 DMOG 抑制羟化酶并诱导 HIF-1 依赖性转录（Nguyen el al. 2013） PHD2 的 2-OG 强烈结合，充当竞争性抑制剂。l2和 DMOG 作为诱导体外模拟细胞缺氧的试剂，诱导缺氧机理如图 17）所示，二者基本涵盖了通过不同的机制上调 HIF-1α蛋白。
图 1-1 哺乳动物昼夜节律分子调控机制（Jennifer el al. 2012）Fig.1-1 The molecular regulation mechanism of mammalian circadian rhythm钟核心基因 Bmal1 编码蛋白 BMAL1 属于碱性-螺旋-环-螺旋（bHL员，是组成生物钟转录、翻译正负反馈机制的核心因子，与另一个生ck 结合形成 BMAL1/CLOCK 二聚体在反馈环中发挥正向调节作用。录 因 子 BMAL1/CLOCK 蛋 白 质 二 聚 体 首 先 激 活 顺 势 作 用 元CGTG-3’）或 E’-box（5’-CACGTT-3’），以启动 Pers 和 Crys 下游基l. 2006）。数小时后，细胞质中积累的 PER 和 CRY 转移进入细胞核CLOCK 的转录活性，从而抑制下游基因的转录激活，形成核心负反k el al. 2012；Richards el al. 2013）。在核心反馈环外围，核受体 RE作为补充机制来参与生物钟 24 h 节律性震荡的产生，BMAL1/CL进 Rev-erbα和 Rorα的转录，反过来，RORα和 REV-ERBα蛋白能通过1的启动子特异序列RRE 上分别促进和抑制Bmal1的转录（Preitner ond el al. 2005；Liu el al. 2008）。此外酪蛋白激酶 CK1ε/δ通过磷酸化到生物钟节律的维持。与此同时，，BMAL1/CLOCK 也通过激活 E-bo
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S827
本文编号：2701608
【图文】：
第一章 缺氧调控细胞生物钟和内质网应激信号通路的研究进展 DMOG 抑制羟化酶并诱导 HIF-1 依赖性转录（Nguyen el al. 2013） PHD2 的 2-OG 强烈结合，充当竞争性抑制剂。l2和 DMOG 作为诱导体外模拟细胞缺氧的试剂，诱导缺氧机理如图 17）所示，二者基本涵盖了通过不同的机制上调 HIF-1α蛋白。
图 1-1 哺乳动物昼夜节律分子调控机制（Jennifer el al. 2012）Fig.1-1 The molecular regulation mechanism of mammalian circadian rhythm钟核心基因 Bmal1 编码蛋白 BMAL1 属于碱性-螺旋-环-螺旋（bHL员，是组成生物钟转录、翻译正负反馈机制的核心因子，与另一个生ck 结合形成 BMAL1/CLOCK 二聚体在反馈环中发挥正向调节作用。录 因 子 BMAL1/CLOCK 蛋 白 质 二 聚 体 首 先 激 活 顺 势 作 用 元CGTG-3’）或 E’-box（5’-CACGTT-3’），以启动 Pers 和 Crys 下游基l. 2006）。数小时后，细胞质中积累的 PER 和 CRY 转移进入细胞核CLOCK 的转录活性，从而抑制下游基因的转录激活，形成核心负反k el al. 2012；Richards el al. 2013）。在核心反馈环外围，核受体 RE作为补充机制来参与生物钟 24 h 节律性震荡的产生，BMAL1/CL进 Rev-erbα和 Rorα的转录，反过来，RORα和 REV-ERBα蛋白能通过1的启动子特异序列RRE 上分别促进和抑制Bmal1的转录（Preitner ond el al. 2005；Liu el al. 2008）。此外酪蛋白激酶 CK1ε/δ通过磷酸化到生物钟节律的维持。与此同时，，BMAL1/CLOCK 也通过激活 E-bo
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S827
【参考文献】
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1 郭金虎;徐璎;张二荃;王晗;何群;殷文璇;冯雪莲;杜生明;;生物钟研究进展及重要前沿科学问题[J];中国科学基金;2014年03期
本文编号：2701608
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