猪伪狂犬gE蛋白的表达及特异性纳米抗体的筛选

发布时间：2020-06-22 14:30

【摘要】：猪伪狂犬病(Porcine Pseudoraibies,PR)又称Aujeszky病,由伪狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)引起,PRV属于疱疹病毒科(Varicello virus)病毒。猪是PRV的天然贮藏宿主,感染猪呈高死亡率、神经系统障碍、繁殖障碍与呼吸道疾病等症状。2011年,我国范围内多个地区报道有猪伪狂犬病的爆发,使我国养猪业损失巨大。对于猪伪狂犬病的防控,已成为当下养猪业的重大课题。前期诊断工作在该病的防控中发挥至关重要的作用。因此建立一种新的特异性高与敏感性强的诊断方法,对于该病的防控至关重要。gE囊膜糖蛋白在PRV中高度保守,是用做诊断技术相关研究工作的理想蛋白。纳米抗体(nanobody)分子量小且具有特异性高、亲和力强、结构稳定、可溶性高、易于进入受体间隙识别特殊抗原表位、可在多系统中表达、生产成本低等优点。目前纳米抗体被广泛应临床检测与诊断中,作为新一代抗体衍生物,纳米抗体具有巨大的应用前景。本研究利用纯化后的gE重组蛋白对双峰驼进行免疫,构建噬菌体展示文库。通过噬菌体展示技术,从富集后的文库中淘选出了2株针对gE重组蛋白的特异性纳米抗体。为后期建立新型猪伪狂犬疾病诊断方法和筛选具有中和活性的纳米抗体,提供必要的实验基础。主要实验内容与结果如下:1、gE重组蛋白的表达与纯化:实验室前期构建保存的PRV重组质粒PET-28a-gE转化入感受态细胞Trans5α中,经过IPTG的诱导后获得了28KaD可溶性的gE重组蛋白。经镍柱层析法纯化后,获得较高纯度的gE重组蛋白。Western-blot验证目的蛋白具有良好的反应原性。2、纯化蛋白免疫双峰驼与噬菌体展示文库的构建将纯化后的2mg gE重组蛋白与弗氏佐剂充分乳化后,免疫双峰驼。6次免疫后,检测血清中针对gE重组蛋白的特异性抗体效价达到1:256000。分离血液淋巴细胞,提取总RNA将其反转录为CDNA。经巢式PCR扩增出VHH基因,扩增后基因与pCANTAB 5E载体连接。重组载体利用电转转化TG1感受态细胞后,获得VHH噬菌体展示文库,鉴定其库容量为5×10~7。菌液PCR与基因测序鉴定文库的阳性率与多样性,结果显示阳性率为99%,基因序列比对显示多样性良好。3、特异性纳米抗体的筛选:以gE重组蛋白作为特异性纳米抗体淘选的包被抗原,3轮淘选后,ELISA检测特异性噬菌体的富集效果。最终筛选出2株针对gE重组蛋白的特异性纳米抗体。综上所述,本研究中,利用原核表达系统获得了1.2 mg/m L可溶性的gE重组蛋白。利用噬菌体展示技术筛选出了针对gE重组蛋白的特异性纳米抗体,为后期建立猪伪狂犬疾病诊断方法和筛选具有中和活性的纳米抗体提供了实验基础。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.28
【图文】：

图 1-1 PRV 基因组的示意图，显示较长的 UL 独特区域和较短的 US 独特区域，反向重复序列（IR 和 TR）。（引自（ Fuchs et al.2002））Figure 1-1 Schematic diagram of the PrV genome showing longer UL unique regions and shorter USique regions, inverted repeats (IR and TR). (cited from (Fuchs et al. 2002))表 1-1 PRV 囊膜蛋白各阶段作用Table1-1 The roles of PRV envelope protein

图 1-2 PRV 病毒粒子结构图 （引自（ Lisa E Pomeran-2 PRV virus particle structure diagram (cited from (Lisa

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本文编号：2725809