SOX2基因敲低对犬乳腺肿瘤细胞增殖和迁移的影响

发布时间：2020-06-22 15:23

【摘要】：犬乳腺肿瘤是母犬最常见的肿瘤之一,犬作为伴侣动物,在生活环境等方面与人类也有很多相似之处,故犬自发性乳腺肿瘤是人乳腺肿瘤的良好模型。SOX2在多种肿瘤中有较高表达,是肿瘤的研究热点,但其在肿瘤发生发展中的机制尚未完全明确。故本试验以分别从犬乳腺肿瘤原发灶和转移灶中分离培养的CHMp和CHMm细胞系为研究对象,探究SOX2对犬乳腺肿瘤不同细胞系增殖和迁移的作用机制。本试验将SOX2基因的siRNA以脂质体作为转染试剂转染进犬乳腺肿瘤细胞CHMp和CHMm中,并检验SOX2的敲低效果。通过CCK-8和克隆形成试验检测各组细胞系的增殖率。划痕愈合试验和Transwell小室迁移试验来检测敲低SOX2后犬乳腺肿瘤细胞系CHMp、CHMm的迁移能力。Western blot检测相关蛋白表达的变化。测定他莫昔芬和顺铂对各组细胞的IC_(50),检测SOX2敲低后犬乳腺肿瘤细胞对他莫昔芬和顺铂的敏感性变化。试验结果:1、为检测转染后细胞SOX2的敲低效果,对各组细胞提取蛋白进行SOX2蛋白表达量的检测,转染3种针对SOX2基因不同位点的siRNA对SOX2的表达进行干扰后,SOX2在蛋白水平的表达量下降,与对照组相比差异极显著(P0.001)。2、CCK-8和克隆形成试验检测细胞增殖能力,与对照组相比,SOX2敲低的CHMp、CHMm细胞的增殖率和克隆形成率均显著下降(P0.001)。3、划痕愈合试验和Transwell小室迁移试验检测细胞迁移能力,SOX2敲低的CHMp、CHMm细胞划痕愈合率和穿过Transwell小室的细胞数量均显著降低(P0.001)。4、SOX2敲低可以抑制Wnt/β-catenin信号通路,SOX2敲低的CHMp、CHMm细胞与对照组细胞相比β-catenin蛋白表达量明显降低,显著性差异(P0.001)。5、SOX2可以抑制Hippo信号通路,SOX2敲低的CHMp、CHMm细胞与对照组细胞相比NF2蛋白表达量明显升高,YAP蛋白表达量明显降低,显著性差异(P0.001)。6、SOX2敲低的CHMp、CHMm细胞EMT标志性蛋白E-cadherin表达量明显升高,N-cadherin、Vimentin表达量均明显降低(P0.001)。7、敲低SOX2后4羟-他莫昔芬和顺铂对犬乳腺肿瘤细胞IC_(50)显著降低(P0.05),犬乳腺肿瘤对4羟-他莫昔芬和顺铂的敏感性升高。综上所述,本试验成功构建了SOX2敲低的犬乳腺肿瘤细胞模型,敲低SOX2可通过抑制Hippo信号通路降低犬乳腺肿瘤细胞增殖和迁移能力,提高犬乳腺肿瘤细胞对他莫昔芬和顺铂的敏感性,进一步完善了SOX2调控乳腺肿瘤的机制,为以SOX2为乳腺肿瘤治疗靶点提供参考。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.292
【图文】：

结果.1 犬乳腺肿瘤细胞 CHMp、CHMm 的 SOX2 敲低效果检测为探究 SOX2 在犬乳腺肿瘤细胞中的作用，用 Lipofectamin 2000 作为转染试剂siRNA 转染至犬乳腺肿瘤细胞 CHMp、CHMm 内对其进行 SOX2 敲低。为检测转染后胞 SOX2 的敲低效果，对各组细胞提取蛋白进行 SOX2 蛋白表达量的检测，试验结果如3-1、3-2 所示，转染试剂组、转染无关基因阴性对照组与空白对照组相比 SOX2 在蛋白平上的表达量相比均无显著性差异（P>0.05）；转染 3 种针对 SOX2 基因不同位点的 siR对 SOX2 的表达进行干扰后，SOX2 在蛋白水平的表达量下降，与对照组相比差异极显（P<0.001）。表明转染试剂及转染无关基因对 CHMp、CHMm 细胞的 SOX2 蛋白水平的表达无影响，3 种针对 SOX2 基因不同位点的 siRNA 均可降低 CHMp、CHMm 细胞SOX2 蛋 白 表 达 。 以 上 证 明 SOX2 敲 低 的 CHMp-siSOX2-A 、 CHMp-siSOX2-CHMp-siSOX2-C、CHMm-siSOX2-A、CHMm-siSOX2-B、CHMm-siSOX2-C 犬乳腺肿细胞模型建立成功，后续试验选择 CHMp-siSOX2-A、CHMp-siSOX2-B、CHMm-siSOX2CHMm-siSOX2-B 作为试验组进行试验。

注：P<0.001，表示差异极显著，标记为***图 3-2 SOX2 敲低效果分析Fig. 3-2 SOX2 knockdown effect analysis3.2 犬乳腺肿瘤细胞敲低 SOX2 后对其细胞增殖能力的影响为探究敲低 SOX2 对犬乳腺肿瘤细胞 CHMp、CHMm 增殖能力的影响，在敲低 SOX2 后24 h 用 CCK-8 法检测各组细胞的增殖能力，并计算各组细胞增殖率。试验结果如图 3-3 所示，与对照组相比，CHMp-siSOX2-A、CHMp-siSOX2-B、CHMm-siSOX2-A、CHMm-siSOX2-B细胞的增殖率均下降，差异极显著（P<0.001）。表明 SOX2 敲低能够显著降低 CHMp、CHMm细胞的增殖能力。

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本文编号：2725863