宠物皮肤致病菌抗菌肽的筛选及纳米乳的制备
发布时间：2020-06-22 17:20
【摘要】：近年来,宠物饲养数量不断增加,宠物疾病也随之而来,特别是犬猫细菌性、真菌性和混合性皮肤病在兽医临床疾病中占有较大的比例,临床上耐多种抗生素的耐药菌株大量产生。抗菌肽在近年来成为抗生素的替代药物,具有高效的、广谱的抗细菌、真菌、病毒和一些原虫等活性,且氨基酸序列较短,合成简便。临床用药上为优化抗菌肽的作用,增加稳定性与安全性,我们筛选短序列抗菌肽应用于纳米给药系统,增加其透皮吸收性,并对其稳定性,安全性和体外抗菌性进行了研究。本实验通过纸片扩散法药敏实验对多种化学固相合成法合成的抗菌肽进行抑菌活性检测,以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为代表菌株,初步筛选出抗菌肽RR-9、RI-12具有理想的抗菌活性。进一步通过最小抑菌浓度(MIC)检测、杀菌浓度检测、杀菌曲线测定、扫描电镜和透射电镜进行验证,结果表明:RR-9、RI-12两种抗菌肽均能同时抑制宠物皮肤常见致病菌标准株的生长,对金黄色葡萄球菌ATCC29213的MIC值分别为16μg/mL和6.6μg/mL。RR-9对临床耐药金黄色葡萄球菌的MIC值为64μg/mL。当RR-9浓度达到4倍MIC值时,可在20分钟内完全杀死金黄色葡萄球菌。电镜结果显示抗菌肽RR-9可快速破坏细菌细胞膜的完整结构,通过使细胞膜破碎、内容物质外流,从而抑制细菌生长,达到杀菌目的。本实验采用已报道配方:肉豆蔻酸异丙酯(IPM)作为油相,辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(EP)作为表面活性剂,聚甘油脂肪酸酯作为助表面活性剂,在此基础上筛选油酸、氮酮最佳比例增加纳米乳稳定性与皮肤渗透性,以此配方制备含有RR-9的抗菌肽纳米乳,并对其进行质量评价,利用紫外分光光度计法建立纳米乳中抗菌肽含量测定方法。实验结果显示油酸和氮酮的最佳比例为1%和2%。粒度分析仪检测得出纳米乳平均粒径为95.3 nm,大小均一,分布均匀。建立的含量检测方法简便易行,准确性高。本研究采用大鼠、家兔的皮肤刺激性实验、急性毒性实验和HaCaT细胞毒性实验考察了包含RR-9的纳米乳的安全性,并且对抗菌肽纳米乳的体外药效进行了评价。结果显示,该抗菌肽纳米乳制剂经皮肤外用未出现急性毒性反应、刺激性反应、过敏性反应,细胞增殖度RGR为61.54%,毒性为2级,无细胞毒性。体外药效实验表明该抗菌肽纳米乳对金黄色葡萄球菌ATCC29213及白色念珠菌ATCC10231的MIC值均为3.9μg/mL,对抗生素抑菌效果较差的耐药金黄色葡萄球菌的MIC值为7.8μg/mL,由此可见包含RR-9的纳米乳抑菌活性优于抗菌肽水溶液。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S859.5
【图文】：
图 1.1 多肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌结果注：左上为阴性对照，右上为氨苄阳性对照Fig 1.1 Result of antibacterial to E. Coli and S.aureus of PeptidesNote: Negative control on the left, the upper right is the ampicillin positive cont1.3.2 抗菌肽对常见致病菌的最小抑菌浓度（MIC）结果结果如表 3.3 所示，RR-9 和 RI-12 对大肠杆菌的 MIC 值分别为 4.8 μg/和 8.3 μg/mL。RR-9 对绿脓杆菌的 MIC 值为 78 μg/mL，远优于氨苄霉素与卡霉素对绿脓杆菌的抗菌效果。RR-9 和 RI-12 对金黄色葡萄球菌的 MIC 值分别16 μg/mL 和 6.6 μg/mL。RR-9 对五种测试菌株具有显著的抗菌活性，并且其革兰氏阴性菌的抗菌活性比对革兰氏阳性菌的抗菌活性高。RI-12 对四种测试株具有显著抗菌活性，抑菌广谱性低于 RR-9。
图 1.2 RR-9 对金黄色葡萄球菌 ATCC29213 的杀菌曲线Fig 1.2 Time-Kill curves of RR-9 against S. aureus ATCC292131.3.5 扫描电镜结果通过大肠杆菌与金黄色葡萄球菌细胞受损部位的扫描电镜观测结果来初预测抗菌肽的作用方式。结果如图 1.3（A、B）所示，阴性组 PBS 处理的大杆菌 ATCC25922（A）表面光滑，具有完整结构。经过 AMP RR-9 处理后（B细菌表面发生了显著的变形、破碎等形态变化。RR-9 抗菌肽对于金黄色葡萄球菌 ATCC29213 的作用如图 1.3（C、D）所对照组中（C），细胞表面光滑，形状规整，呈典型的葡萄球形，而经过抗菌处理组（D）中葡萄球菌菌体形态发生了显著变化，可见细胞表面皱缩、破碎形状不规则。由此可见抗菌肽对两种细菌均表现了明显的破坏作用。
本文编号：2725990
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S859.5
【图文】：
图 1.1 多肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌结果注：左上为阴性对照，右上为氨苄阳性对照Fig 1.1 Result of antibacterial to E. Coli and S.aureus of PeptidesNote: Negative control on the left, the upper right is the ampicillin positive cont1.3.2 抗菌肽对常见致病菌的最小抑菌浓度（MIC）结果结果如表 3.3 所示，RR-9 和 RI-12 对大肠杆菌的 MIC 值分别为 4.8 μg/和 8.3 μg/mL。RR-9 对绿脓杆菌的 MIC 值为 78 μg/mL，远优于氨苄霉素与卡霉素对绿脓杆菌的抗菌效果。RR-9 和 RI-12 对金黄色葡萄球菌的 MIC 值分别16 μg/mL 和 6.6 μg/mL。RR-9 对五种测试菌株具有显著的抗菌活性，并且其革兰氏阴性菌的抗菌活性比对革兰氏阳性菌的抗菌活性高。RI-12 对四种测试株具有显著抗菌活性，抑菌广谱性低于 RR-9。
图 1.2 RR-9 对金黄色葡萄球菌 ATCC29213 的杀菌曲线Fig 1.2 Time-Kill curves of RR-9 against S. aureus ATCC292131.3.5 扫描电镜结果通过大肠杆菌与金黄色葡萄球菌细胞受损部位的扫描电镜观测结果来初预测抗菌肽的作用方式。结果如图 1.3（A、B）所示，阴性组 PBS 处理的大杆菌 ATCC25922（A）表面光滑，具有完整结构。经过 AMP RR-9 处理后（B细菌表面发生了显著的变形、破碎等形态变化。RR-9 抗菌肽对于金黄色葡萄球菌 ATCC29213 的作用如图 1.3（C、D）所对照组中（C），细胞表面光滑，形状规整，呈典型的葡萄球形，而经过抗菌处理组（D）中葡萄球菌菌体形态发生了显著变化，可见细胞表面皱缩、破碎形状不规则。由此可见抗菌肽对两种细菌均表现了明显的破坏作用。
【参考文献】
相关期刊论文 前3条
1 薛占永;刘伟;张宁宁;林德贵;;犬细菌性皮肤病病原菌的分离鉴定与药敏试验[J];中国兽医杂志;2008年12期
2 于爱华;翟光喜;崔晶;刘宏;;葛根素固体自微乳的研制[J];中药材;2006年08期
3 沈海蓉,李中东,钟明康;阿托伐他汀自微乳释药系统的制备和评价[J];药学学报;2005年11期
相关硕士学位论文 前1条
1 聂林燕;林蛙皮多肽提取工艺建立及化妆品初步研制[D];吉林大学;2017年
本文编号：2725990
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