丁酸钠对牛乳腺上皮细胞内源性抗菌肽诱导表达及抗金黄色葡萄球菌感染的研究

发布时间：2020-06-23 00:31

【摘要】：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是导致奶牛乳房炎的主要致病菌之一,引起的抗生素耐药性和慢性炎症问题日益突出。作为疾病控制的新策略,抗菌肽通常是由动物细胞天然产生的,几乎对所有类别的病原体有效且极难产生抗性。丁酸钠不仅是一种短链脂肪酸类营养化合物,还是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)。有研究报道称丁酸钠能通过HDACi作用诱导动物内源性抗菌肽表达,同时还能发挥抑菌抗炎的作用效果,但其确切分子机制尚不清楚。因此,本研究通过全面了解丁酸钠对动物内源性抗菌肽诱导表达的影响以及明确丁酸钠对炎症相关信号通路的调控机制,为有效预防和控制金黄色葡萄球菌感染引起的奶牛乳房炎提供了分子领域的理论依据。本研究以牛乳腺上皮细胞(MAC-T)为细胞模型。首先,观察丁酸钠对细胞内源性抗菌肽基因表达的诱导效果。接着,利用基因转录组学查找并验证关键转录因子、细胞信号转导通路及microRNA对丁酸钠调控细胞内源性抗菌肽基因表达的影响。然后,观察丁酸钠在金黄色葡萄球菌感染细胞中的抑菌效果。最后,阐明丁酸钠缓解金黄色葡萄球菌外毒素脂磷壁酸(LTA)引起细胞炎症反应的信号转导机制。主要试验结果如下:(1)研究结果表明丁酸钠能上调MAC-T细胞内源性抗菌肽的表达,包括β-defensin类抗菌肽DEFB1、DEFB3、DEFB4、DEFB5、DEFB6、DEFB8、DEFB9、DEFB10、DEFB11、DEFB12、DEFB13、LAP、TAP、BPTI和EBD,以及cathelicidin类抗菌肽Bac1、Bac5、Indolicidin、BMAP-28、BMAP-27和BMAP-34。抗菌肽基因以剂量和时间依赖性方式被丁酸钠诱导,其中以DEFB1和BMAP-34的表现最为显著。丁酸钠以剂量依赖性方式上调了MAC-T细胞组蛋白乙酰化水平,并对DEFB5、Indolicidin和BMAP-34基因的诱导表达能力均高于曲古霉素(TSA)。MAC-T细胞各表达了GPR41和GPR43的牛同源受体蛋白和mRNA,丁酸钠处理后其表达量均上调。利用特异性siRNA分别沉默GPR41和GPR43均不同程度地减弱了丁酸钠诱导DEFB5、DEFB10和BMAP-34基因上调表达,以DEFB10的减弱效果最为显著。(2)基因转录组测序结果表明EBD、TAP、DEFB5、DEFB1、DEFB4、LAP和BMAP-34基因均出现了上调差异表达,实时定量PCR验证了该结果。所评估的抗菌肽基因启动子上游区域均预测出了AP-1和DBP两个转录因子的转录结合位点。抑制p38和NF-κB途径分别下调了丁酸钠诱导的BMAP-34和DEFB1基因表达水平。抑制ERK途径下调了丁酸钠诱导的BMAP-34表达,但却上调了DEFB1表达,与之相反,抑制JNK途径上调了丁酸钠诱导的BMAP-34表达,同时下调了DEFB1表达。Western blot结果表明bta-miR-677对MAC-T细胞组蛋白乙酰化有显著的正调节作用,而bta-miR-2440对其没有显著影响。bta-miR-677对MAC-T细胞BMAP-34和DEFB1基因起上调表达作用,bta-miR-2440只在丁酸钠诱导BMAP-34基因表达中起抑制作用。(3)丁酸钠以浓度和时间依赖性方式抑制金黄色葡萄球菌感染MAC-T细胞。透射电镜观察结果表明丁酸钠降低了金黄色葡萄球菌感染MAC-T亚细胞结构的破坏程度。金黄色葡萄球菌感染增加了MAC-T细胞TNF-α、IL-1β、IL-6、TLR2、NOD1和NOD2基因表达,而预处理丁酸钠减弱了这些增加。随着金黄色葡萄球菌感染MAC-T细胞时间增加,BMAP-34和TAP基因表达也随之增加,预处理丁酸钠后,BMAP-34和TAP基因表达随细菌感染时间增加而出现进一步地上调。丁酸钠显著地减轻了金黄色葡萄球菌感染小鼠乳腺组织所引起的病理性损伤和炎症反应。(4)丁酸钠显著上调了MAC-T细胞组蛋白H3乙酰化水平和BMAP-34、TAP、DEFB1、DEFB5抗菌肽基因表达量,LTA单独刺激MAC-T细胞没有显著上调组蛋白乙酰化水平,预处理丁酸钠后LTA刺激MAC-T细胞进一步上调了组蛋白乙酰化水平和抗菌肽基因表达量。预处理丁酸钠抑制了LTA诱导的MAC-T细胞TNF-α、IL-1β和IL-6基因表达,增强了IL-10基因表达。LTA显著诱导了NF-κB p65亚基的活化和IκBα的降解,预处理丁酸钠降低了LTA所诱导的NF-κB p65和IκBα磷酸化水平并减少了NF-κB p65的核易位。丁酸钠显著增强了LTA诱导的MAC-T细胞中p38和ERK磷酸化蛋白表达水平,同时减弱了JNK、AMPKα和ACCα磷酸化蛋白表达水平。LTA刺激MAC-T细胞后TLR2、NLRP3、ASC和caspase-1、IL-1β的蛋白表达水平均显著增加,这种增加通过MAC-T细胞预处理丁酸钠而被减弱。总之,本研究证实了丁酸钠能诱导牛乳腺上皮细胞(MAC-T)内源性抗菌肽基因上调表达,HDACi、短链脂肪酸受体GPR41/GPR43、NF-κB途径、MAPKs途径和microRNA参与了抗菌肽基因表达的调控。同时,丁酸钠在金黄色葡萄球菌感染和LTA刺激的MAC-T细胞中发挥了抑菌抗炎作用,其作用与抑制TLR2/NF-κB/NLRP3途径和增强内源性抗菌肽基因表达有关。
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.23

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本文编号：2726496