猪流行性腹泻病毒变异株的分离鉴定及主要基因遗传进化分析

发布时间：2020-07-03 02:06

【摘要】：猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是冠状病毒科冠状病毒属的成员,引起的猪流行性腹泻可使猪群出现腹泻、呕吐等症状,其中,1周龄仔猪发病较为严重,死亡率可达100%。最近几年,PEDV再次出现爆发流行,世界各国均有报道,中国大部分省市猪群均有感染,给生猪养殖业造成了巨大的损失。此次PEDV的再次流行,与以往流行毒株相比,差异较大,出现了新的变异流行毒株,现有疫苗对其保护力差。因此,加强对新发变异毒株的研究,对PEDV的防控具有重要意义。本研究采集来自吉林省德惠市某猪场疑似PEDV感染致死的仔猪肠组织样品,采用Vero E6细胞进行病毒的分离培养。培养时采用添加胰蛋白酶的方法,成功分离到1株PEDV,并对其进行形态学、分子生物学和血清学鉴定,测定其TCID_(50)并进行动物致病性试验;对分离株的全基因序列进行扩增并测序,利用DNASTAR、MEGA 6.0等软件将其与GenBank上已公布的参考序列进行同源性比对分析,绘制遗传进化树,分析其主要基因S、ORF3、M及N基因的序列特征。本研究中肠组织样品经无菌处理接种Vero E6细胞后,盲传至第4代出现了细胞病变。病变表现为细胞变圆破碎和脱落,经过形态学观察和血清学鉴定,证明分离到的病毒为PEDV,暂命名为CH/JLDH/2016株;通过分子生物学纳米巢式PCR的方法,证明分离株为变异毒株;传至16代时,病毒含量较为稳定,为10~(5.2) TCID_(50)/mL;通过动物致病性试验,证明分离株对仔猪具有致病性。为了解该分离株的变异特点,本研究对CH/JLDH/2016株进行了全基因扩增和测序,并选取S、ORF3、M和N基因进行分析。结果显示,S基因变异较为显著,有16处的核苷酸插入和10处核苷酸的缺失,并且存在多处核苷酸突变,导致5个氨基酸插入和3个氨基酸缺失。在COE表位(499~638aa)有10处氨基酸改变,在SS6表位第766位氨基酸位点由Y变为S。S、ORF3、M和N基因与NCBI上参考毒株同源性分别为93.6%~99.1%、91.3%~99.4%、97.4%~99.7%和95.7%~99.5%。基于S、M和N基因的遗传进化分析表明,该毒株与疫苗株均不处于同一分支,亲缘关系较远,与近几年流行毒株遗传距离较近;基于ORF3基因的遗传进化分析显示,分离株虽与疫苗株CV777处于同一群,但分属于不同亚群。对不同基因的遗传进化分析结果表明,该分离株主要结构基因变异趋势一致。上述研究结果提示,吉林省存在PEDV变异毒株的流行。本研究采用接毒时添加胰蛋白酶的方法,成功分离到了1株PEDV变异毒株,可在Vero E6细胞上稳定传代,并且对仔猪具有致病性,可为疫苗的研发提供候选毒株;通过对分离株主要基因的序列分析,有助于了解PEDV流行毒株的变异情况,丰富PEDV分子流行病学资料。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.651
【图文】：

细胞病变

集粪便或肛门拭子，进行 PEDV PCR 检测。.2.9.2 动物攻毒 7 日龄仔猪分为 2 组，每组 3 只。实验组每只仔猪灌服细胞毒 25 mL照组每只灌服未接毒细胞培养物对照 25 mL。隔离饲养，每隔 12 h 观察仔猪状态，粪便或肛门拭子进行 PCR 检测。如有仔猪死亡或安乐死后，进行剖检，采集小肠组病理切片和免疫组化实验，并进行 PCR 检测，收集小肠组织进行病毒分离。1.3 结果.3.1 病毒分离培养结果将 PCR 检测为阳性的肠组织病料处理液单层接种于 Vero E6 细胞后，从 2016 年吉德惠市某猪场采集的病死猪肠组织处理液分离到 1 株病毒，盲传 4 代时出现明显细胞，CPE 开始表现为细胞变圆，随着时间增加，表现为细胞破碎，之后表现为细胞脱落照组细胞生长状态良好，无病变现象，如图 1.1。继续进行传代，每代次病变达到 80间约为 35 h。

巢式PCR,纳米,纤突

纳米巢式 PCR 第 1 轮扩增结果 B：纳米巢式 PCR 第 2 轮扩增结000 Marker；1：CH/JLDH/2016 分离株；2：PEDV 经典毒株；3：图 1.2 纳米巢式 PCR 扩增结果Fig1.2 Amplification results of nano-nest PCR结果观察结果染后，在透射电子显微镜下观察到了形态完整的病毒粒子粒子表面有花瓣状纤突，病毒颗粒直径（包含纤突部分）约

【参考文献】