水貂肠炎病毒NS1非结构蛋白调控细胞凋亡的分子机制

发布时间：2020-07-03 23:41

【摘要】：水貂病毒性肠炎(Mink viral enteritis,MVE)是由水貂肠炎病毒(Mink enteritis virus,MEV)引起水貂一种高度接触性、急性传染病,具有高发病率和高死亡率特点,其中幼貂极易感染。MEV DNA基因组包含两个主要的开放阅读框:编码非结构蛋白NS1和NS2以及结构蛋白VP1和VP2,其中NS1非结构蛋白主要调节MEV复制,反式激活编码病毒结构蛋白。目前已经被证实多种细小病毒NS1具有细胞毒性且能诱导细胞凋亡,因此细小病毒NS1一直是研究的热点。目前MEV及其NS1诱导细胞凋亡的分子机理仍不明确。本研究旨在通过分析MEV及其NS1诱导细胞凋亡的信号途径及其作用机制,为揭示MEV引起水貂致病机理奠定理论基础。为了揭示MEV在体内、体外是否能诱导细胞凋亡的发生。体内方面,我们将MEVB细胞毒株感染健康的水貂,分析体内消化道各个组织细胞凋亡情况。结果分析发现,感染病毒的水貂消化道组织出现不同程度的病理变化;采用TUNEL方法检测凋亡细胞,发现被病毒感染水貂的食管、小肠、肠系膜淋巴结、肾脏中发现有凋亡细胞,而舌没有发现细胞凋亡情况。体外方面研究发现MEVB感染F81细胞后,能显著抑制细胞的生长,并且导致细胞在G1期的积累,诱导细胞凋亡的发生。这些结果表明MEV在体内、体外均能诱导细胞凋亡的发生。为了进一步确定MEV NS1、NS2、VP1和VP2是否能诱导细胞凋亡的发生,我们分别构建MEV NS1、NS2、VP1和VP2真核表达质粒,转染到F81和HEK293T细胞中分析诱导细胞凋亡情况。研究显示NS1能显著抑制F81和HEK293T细胞活性,对细胞产生毒性反应,然而VP1和VP2不能抑制细胞活性且不能产生细胞毒性。利用流式细胞术检测NS1、NS2、VP1和VP2对细胞周期和细胞凋亡情况的影响,结果显示NS1能导致F81和HEK293T细胞周期阻滞在G1期,同时采用Annexin V-FITC/PI试剂盒检测发现,NS1能诱导细胞凋亡的发生。进一步研究发现MEV NS1能导致细胞核呈现碎块状致密浓染、并且能产生DNA Ladder现象,电镜发现染色质浓缩,细胞核凝聚形成大小不等,产生凋亡小体。这些结果表明MEV NS1具有诱导细胞凋亡的能力,而NS2、VP1和VP2不能诱导细胞凋亡。在上述研究的基础上,进一步分析MEV NS1引起细胞凋亡的作用机制。利用Western blot、免疫荧光和流式细胞术分析MEV NS1对细胞内Caspase和凋亡相关蛋白的影响。发现NS1能激活Caspase-9和Caspase-3,而Caspase-8和Caspase-12没有被活化;同时发现NS1能使Bax/Bcl-2比值升高,Bcl-2(Ser 70)磷酸化;促进Bax从胞浆中转位进入线粒体,Cyt C线粒体释放进入细胞质中诱导凋亡发生;NS1能降低线粒体膜电位、提高线粒体膜通透性并且导致细胞内ROS积累;NS1能抑制p38 MAPK和p53启动子活性,还能导致p38 MAPK(Thr 180/Tyr 182)和p53(Ser 15)、p53(Ser 20)发生磷酸化;为了进一步揭示其作用机制,我们用p38 MAPK和p53特异性抑制剂预处理细胞,结果显示NS1诱导细胞凋亡的能力显著下降。综合以上研究结果表明,MEV NS1通过线粒体介导的细胞凋亡途径诱导凋亡,同时p38 MAPK和p53在NS1诱导细胞凋亡过程中起到重要的调节作用。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65
【图文】：

图 1-1 细小病毒 DNA 基因组结构 (Carter and Saunders, 2007; Kerr et al., 2006; King et al., 201igure 1-1 Parvovirus genome structure (Carter and Saunders, 2007; Kerr et al., 2006; King et al., 20图 1-2 CPV VP2 蛋白二级结构示意图 (Xie; Chapman, 1996)-2 Location of secondary structural elements within the primary sequence of CPV VP2 (Xie; Chapm病毒在基因组结构上有一个显著的特征是在 DNA 两端含有回文结构形成的 B）。3 端的回文结构长约 200 nt，形成的 Y 型结构，5 端回文结构长约

CPVVP2蛋白二级结构示意图(Xie;Chapman,1996)

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本文编号：2740331