羊口疮病毒文登株和石林株毒力致弱及毒力相关基因的生物信息学分析

发布时间：2017-03-29 11:16

  本文关键词：羊口疮病毒文登株和石林株毒力致弱及毒力相关基因的生物信息学分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：羊口疮(Contagious pustular dermatitis,CPD),也被称作接触传染性脓疱皮炎,是由羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)引起的一种使山羊、绵羊及一些野生反刍动物等发生传染性脓疮的动物传染性疾病。随着我国山羊养殖规模和密度的不断增加,各地区羊只相互频繁引种交易,使得羊口疮的发病率和羔羊致死率居高不下,给各地养殖户造成了严重经济损失。虽然目前有使用灭活疫苗或弱毒疫苗来进行羊口疮病的防治,但其保护率和交叉免疫效果仍然不佳,加之与羊口疮病毒毒力相关的基因参与到宿主免疫逃避中,给该病的防控也增加了难度。本研究以采集的山东文登、云南石林羊口疮痂毒为原料,以犊牛睾丸原代细胞、1月龄羔羊为试验材料,通过特征性细胞病变观察、特异基因B2L的PCR检测、病毒滴度测定、动物回归试验及病毒传代致弱、羊体安全性试验、免疫攻毒保护试验等方法进行野毒株分离鉴定和毒力致弱研究;并克隆羊口疮病毒文登、石林强弱毒株的GIF、vIL-10基因,进行生物信息学分析,比较其在强弱毒间的基因差异。获得试验结果如下:1.羊口疮病毒文登株与石林株的分离与鉴定结果表明:痂毒盲传至第4代时产生羊口疮特征性细胞病变,测得第5代文登株和石林株分离病毒滴度分别为106.56TCID50/mL,107.30 TCID50/mL;B2L基因PCR产物测序结果与GenBank上公布的其他国内外31个参考毒株B2L基因相应部分的核苷酸序列相似性均达到99%;第5代细胞适应毒划痕接种羔羊3天后引起羔羊发病,症状与临床上自然感染羊口疮的羊只相同。结果表明,本试验成功分离得到ORFV山东文登株和云南石林株;2.羊口疮病毒文登株和石林株毒力致弱及GIF、vIL-10基因生物信息学分析结果如下:传至90代的羊口疮病毒文登株和石林株的病毒滴度分别为103.40 TCID50/mL、103.90TCID50/mL,随传代次数增多,毒力越来越弱;两株P90毒株划痕接种羔羊后均未现羊口疮特征性病变;免疫攻毒结果显示,8只免疫羊得到100%的保护。表明ORFV文登株和石林株病毒经细胞连续传代后毒力减弱,免疫原性良好,试验获得2株羊口疮病毒的弱毒株。生物信息分析结果显示:4株病毒株的GIF基因组全长均为798 bp,编码265个氨基酸。石林强弱毒株间GIF基因核酸共发生4处变异,文登强弱毒间有2个变异位点;石林强弱毒株间GIF基因存在4个氨基酸位点差异,文登强弱毒株间有1个氨基酸变异。文登株氨基酸变异意义不大,石林强毒株在致弱过程由于4个位点氨基酸产生变异,导致在第250位附近α螺旋结构消失;4株病毒株的vIL-10基因组全长均为558 bp,编码的氨基酸个数均为185个。文登强弱毒株vIL-10基因核酸有27处变异,氨基酸发生13处突变;石林强弱毒株间vIL-10基因核酸共发30处变异,比文登株多了第32位(T→C)、61位(G→A)、88位(G→A)位突变;导致氨基酸发生16处突变,比文登株多了11位(Val→Ala)、21位(Asp→Asn)、30位(Gly→Ser)突变。证明羊口疮病毒毒力相关基因在强弱毒株之间存在不同程度的基因变异。在进一步的分析中得知,这些变异直接导致了石林、文登强弱毒株20-40位、120位、160位左右的氨基酸残基形成α螺旋、β折叠、无规则卷曲的概率的变化;氨基酸的亲水性也发生相对变化;强、弱毒株间vIL-10蛋白抗原指数也发生多处变化。
【关键词】：羊口疮 分离鉴定 毒力致弱 生物信息分析
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 文献综述13-24
• 第一章 羊口疮研究进展13-24
• 1.1 前言13
• 1.2 分子生物学特征13-15
• 1.2.1 病毒的形态结构13-14
• 1.2.2 病毒的基因组结构14-15
• 1.2.3 病毒增殖培养特性15
• 1.3 流行病学特征15
• 1.4 临床症状与病理变化15-16
• 1.5 与发病机制和病毒毒力相关的基因研究16-20
• 1.5.1 Bcl-2 样细胞凋亡抑制因子16-17
• 1.5.2 NF-κB信号通路抑制剂17
• 1.5.3 干扰素抑制基因（OVIFNR）17
• 1.5.4 病毒白细胞介素-10（ORFV-IL-10）17-18
• 1.5.5 趋化因子阻遏蛋白（CBP）18
• 1.5.6 GM-CSF/IL-2 抑制因子（GIF）18-19
• 1.5.7 血管内皮生长因子（VEGF）19-20
• 1.6 鉴别与诊断方法20-22
• 1.6.1 组织病理学检查20
• 1.6.2 电子显微镜观察20
• 1.6.3 免疫电子显微镜观察20
• 1.6.4 病毒分离与鉴定20-21
• 1.6.5 PCR检测21
• 1.6.6 ELISA检测21
• 1.6.7 病毒中和试验和补体结合试验21-22
• 1.6.8 Western blotting22
• 1.6.9 限制性片段长度多态性分析（RFLP）22
• 1.7 本研究的目的意义22-24
• 试验研究24-54
• 第二章 羊口疮病毒文登株与石林株的分离与鉴定24-32
• 2.1 材料24-25
• 2.1.1 病料24
• 2.1.2 试验动物24
• 2.1.3 细胞24
• 2.1.4 主要试剂24
• 2.1.5 主要仪器24-25
• 2.1.6 主要溶液配方25
• 2.2 方法25-27
• 2.2.1 病料采集与处理25
• 2.2.2 犊牛睾丸原代细胞的制备25-26
• 2.2.3 羊口疮病毒分离26
• 2.2.4 病理组织切片的制备26
• 2.2.5 PCR鉴定26
• 2.2.6 病毒滴度测定26
• 2.2.7 动物回归试验26-27
• 2.3 结果27-30
• 2.3.1 羊口疮患病羊痂皮组织病理学观察27
• 2.3.2 分离病毒引起的细胞特征性病变27-28
• 2.3.3 分离毒株的PCR检测28
• 2.3.4 病毒滴度测定结果28-29
• 2.3.5 病毒分离株动物回归试验29-30
• 2.4 讨论30-31
• 2.5 小结31-32
• 第三章 羊口疮病毒文登株和石林株毒力致弱及强弱毒株毒力相关基因的生物信息学分析32-54
• 3.1 材料32-33
• 3.1.1 病毒32
• 3.1.2 试验动物32
• 3.1.3 细胞株和菌株32
• 3.1.4 主要试剂32
• 3.1.5 主要仪器32
• 3.1.6 主要溶液配方32-33
• 3.2 方法33-36
• 3.2.1 羊口疮病毒文登株和石林株毒力致弱33-34
• 3.2.2 羊口疮病毒文登株和石林株强弱毒株间GIF、vIL-10生物信息学分析34-36
• 3.3 结果36-51
• 3.3.1 羊口疮病毒文登株和石林株毒力致弱36-40
• 3.3.2 羊口疮病毒文登、石林强弱毒株GIF、vIL-10基因扩增40-42
• 3.3.3 基因的生物信息学分析42-51
• 3.4 讨论51-53
• 3.4.1 病毒的致弱及弱毒株鉴定51-52
• 3.4.2 基因的生物信息学分析52-53
• 3.5 小结53-54
• 结论54-55
• 参考文献55-62
• 致谢62-63
• 作者简介63

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本文编号：274353