RNAscope原位杂交技术检测PRRSV方法的建立及初步应用
发布时间：2020-07-08 07:42
【摘要】：RNAscope原位杂交(RNAscope in situ hybridization,简称RNAscope~?)是一种新型原位杂交技术,其原理为碱基互补配对原则,结合信号级联放大技术和背景抑制策略使得该技术在实验室检测中具有一定优势。本实验利用RNAscope~?成功检测到感染动物组织切片中的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV),并对其特异性进行检测,结果显示,该技术在PRRSV检测中具有较高特异性。将RNAscope~?、原位杂交技术(In situ hybridization,ISH)和免疫组织化学技术(Immunohistochemistry,IHC)进行比较时,在连续切片上分别使用三种技术检测PRRSV,定量分析阳性结果表明,RNAscope~?具有更高的敏感性。图像分析结果显示,在肺脏中,RNAscope~?与ISH阳性信号的位置与数量基本一致,然而IHC结果显示PRRSV阳性信号明显少于前两者。在胸腺组织中,RNAscope~?阳性信号在皮质区大量出现;ISH检测中,阳性信号在皮质区局部出现;而IHC结果中,胸腺皮质区PRRSV阳性信号较少。在淋巴结组织中,三种技术检测PRRSV呈现的阳性信号出现的位置一致,但是RNAscope~?信号数量最多,IHC检测结果次之,ISH阳性信号少于前两者。初步数据统计结果显示,RNAscope~?的敏感性显著高于ISH和IHC。为扩展RNAscope~?和IHC技术在兽医学领域的应用范围,本研究以PRRSV感染的组织石蜡切片为样本,建立了RNAscope~?与IHC双重染色技术。该技术结合RNAscope~?独特探针与IHC特异性抗原两大优势,实现了在同一切片上核酸与蛋白的双重检测。在肺脏及淋巴结中,利用RNAscope~?检测PRRSV结合IHC检测巨噬细胞,结果显示RNAscope~?与IHC均呈现出较好的特异性和敏感性。PRRSV感染宿主后,会引起细胞凋亡,基于此在组织切片上应用RNAscope~?检测宿主凋亡相关调节基因Bid和Bcl-xl结合IHC检测PRRSV双重染色,结果可以发现PRRSV感染组织中的Bid基因表达水平有上调趋势,Bcl-xl基因表达水平有下调趋势,表明该技术在检测内源性基因过程中也有良好表现。综上,本研究成功建立了RNAscope~?与IHC双重染色技术。本研究应用RNAscope~?技术成功检测到组织切片中的PRRSV核酸,同时证明该技术操作简便,并具有高度的特异性、敏感性和重复性。RNAscope~?与IHC双重染色结果证实该技术不仅在病毒检测中具有高敏感性,在内源基因表达及信号转导等基础研究中也有广泛的应用前景。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.651
【图文】：
与呼吸综合征是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive anvirus，PRRSV）引起的重要的猪传染性疾病，世界动物卫生组织（Office inte，OIE）将其列为 B 类传染病。近三十年来给世界范围内的养猪业带来沉重家推算，每头十八周龄发病猪将造成接近 121.5 美元的经济损失(Nieuw重的经济学和生态学影响促使该病成为目前猪病领域中的研究热点和重点，验室正在对该病的致病机理进行深入研究。原学特点 病毒粒子呈球形, 为直径 60~65 nm 的有囊膜的 RNA 病毒(Wensvoort, 1991性，仅感染猪。目前该病毒有两个基因型分别为欧洲型（1 型）和美洲型999)。在病毒分类学中，PRRSV 与马动脉炎病毒（Equine arteritis virus，EA增高症病毒（Lactate dehydrogenase elevating virus，LDV）和猴出血热病ic fever virus，SHFV）等同为尼多病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒rg et al., 1993)。妊娠母猪感染 PRRSV 会发生流产、早产、产出死胎或木乃伊猪会出现严重的呼吸道症状，造成缺氧，从而出现机体末端例如耳朵发紫被称为蓝耳病(Rahe et al., 2017)或神秘猪病。
硕士学位论文 原位杂交技术。该技术采用标准微拷贝技术增强对于 mRNA 的检scope 技术的原理是基于碱基互补配对原则，结构独特的双 Z 形探合，再通过信号放大系统标记目的序列作为阳性信号呈现在镜下（点在于双 Z 探针的设计，该探针的结构为三段式 Z 型，下端为靶标中核酸结合的核心区域，长度约为 25 bp；上端为信号放大结合区统的骨架根据碱基互补配对原则结合，为信号结合提供支架，长度上端和下端的作用。探针的成对设计使得非目的序列上的单个 Z 探，大大降低了背景和噪点。该技术能够实现短序列 mRNA 甚至单个益于这一点，进而可以扩展到 RNAscope 的一个特殊的功能，就是降存时间较长的样本中，RNA 存在降解，但只要片段长度不小于 50 b技术的敏感性，克服了 RNA 容易降解的问题。
引入到这一诊断领域中能够互补目前的主流检测手段(Yu et al.)。Talita 等在猪各组织器官中检测猪塞内加谷病毒(Seneca valley virus，SVV)时发现，在临床中认为是机械损伤的舌面溃烂处RNAscope 检测发现了 SVV 的存在，同时也通过 PCR 的技术确定了这一诊断的正确性，因此怀疑该病毒在损伤组织中易感(Resende et al., 2017)。同时 RNAscope 的技术优势为其在基础研究中的推广与接受奠定了基础。Kim 等在对乳腺分叶状肿瘤的恶化程度分级中，发现在 RNAscope 诊断结果中，随着肿瘤恶性程度的加重，富含半胱氨酸的酸性基质蛋白的 RNA 水平和蛋白水平均显著上调，一定程度上证明了该类型蛋白与肿瘤恶化相关(Kim et al., 2017)。在研究炎症的相关机理时，应用 RNAscope 确定关键因子 ACN9不仅在肺脏上皮组织中存在，也是肺脏淋巴组织中的重要表达因子，深入研究发现将该因子沉默会促进炎性因子的表达(Jeong et al., 2017)。通过对相关基因在神经细胞病变区的分布和表达量改变的检测，发现基因表达的不同调节机制(Kanaan et al., 2015)。利用不同的关键标志物来区分不同极化状态的巨噬细胞来研究病原或肿瘤发生时，巨噬细胞的形态学和功能学的改变，同时针对重要细胞因子的检测，也对胰腺癌的相关临床症状进行了简单的解释(Liou et al., 2017)。RNAscope 在医学领域和生物研究中得到高度的认可，不仅能够利用肿瘤标记物来快速诊断癌症的发生与发展，同时也为基础研究提供了一个新的平台和方向。目前，在兽医学领域的各方面都应用较少，但是 RNAscope 技在医学领域的成功推广提示着该技术也将为兽医学领域带来一场技术的革命。
本文编号：2746285
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.651
【图文】：
与呼吸综合征是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive anvirus，PRRSV）引起的重要的猪传染性疾病，世界动物卫生组织（Office inte，OIE）将其列为 B 类传染病。近三十年来给世界范围内的养猪业带来沉重家推算，每头十八周龄发病猪将造成接近 121.5 美元的经济损失(Nieuw重的经济学和生态学影响促使该病成为目前猪病领域中的研究热点和重点，验室正在对该病的致病机理进行深入研究。原学特点 病毒粒子呈球形, 为直径 60~65 nm 的有囊膜的 RNA 病毒(Wensvoort, 1991性，仅感染猪。目前该病毒有两个基因型分别为欧洲型（1 型）和美洲型999)。在病毒分类学中，PRRSV 与马动脉炎病毒（Equine arteritis virus，EA增高症病毒（Lactate dehydrogenase elevating virus，LDV）和猴出血热病ic fever virus，SHFV）等同为尼多病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒rg et al., 1993)。妊娠母猪感染 PRRSV 会发生流产、早产、产出死胎或木乃伊猪会出现严重的呼吸道症状，造成缺氧，从而出现机体末端例如耳朵发紫被称为蓝耳病(Rahe et al., 2017)或神秘猪病。
硕士学位论文 原位杂交技术。该技术采用标准微拷贝技术增强对于 mRNA 的检scope 技术的原理是基于碱基互补配对原则，结构独特的双 Z 形探合，再通过信号放大系统标记目的序列作为阳性信号呈现在镜下（点在于双 Z 探针的设计，该探针的结构为三段式 Z 型，下端为靶标中核酸结合的核心区域，长度约为 25 bp；上端为信号放大结合区统的骨架根据碱基互补配对原则结合，为信号结合提供支架，长度上端和下端的作用。探针的成对设计使得非目的序列上的单个 Z 探，大大降低了背景和噪点。该技术能够实现短序列 mRNA 甚至单个益于这一点，进而可以扩展到 RNAscope 的一个特殊的功能，就是降存时间较长的样本中，RNA 存在降解，但只要片段长度不小于 50 b技术的敏感性，克服了 RNA 容易降解的问题。
引入到这一诊断领域中能够互补目前的主流检测手段(Yu et al.)。Talita 等在猪各组织器官中检测猪塞内加谷病毒(Seneca valley virus，SVV)时发现，在临床中认为是机械损伤的舌面溃烂处RNAscope 检测发现了 SVV 的存在，同时也通过 PCR 的技术确定了这一诊断的正确性，因此怀疑该病毒在损伤组织中易感(Resende et al., 2017)。同时 RNAscope 的技术优势为其在基础研究中的推广与接受奠定了基础。Kim 等在对乳腺分叶状肿瘤的恶化程度分级中，发现在 RNAscope 诊断结果中，随着肿瘤恶性程度的加重，富含半胱氨酸的酸性基质蛋白的 RNA 水平和蛋白水平均显著上调，一定程度上证明了该类型蛋白与肿瘤恶化相关(Kim et al., 2017)。在研究炎症的相关机理时，应用 RNAscope 确定关键因子 ACN9不仅在肺脏上皮组织中存在，也是肺脏淋巴组织中的重要表达因子，深入研究发现将该因子沉默会促进炎性因子的表达(Jeong et al., 2017)。通过对相关基因在神经细胞病变区的分布和表达量改变的检测，发现基因表达的不同调节机制(Kanaan et al., 2015)。利用不同的关键标志物来区分不同极化状态的巨噬细胞来研究病原或肿瘤发生时，巨噬细胞的形态学和功能学的改变，同时针对重要细胞因子的检测，也对胰腺癌的相关临床症状进行了简单的解释(Liou et al., 2017)。RNAscope 在医学领域和生物研究中得到高度的认可，不仅能够利用肿瘤标记物来快速诊断癌症的发生与发展，同时也为基础研究提供了一个新的平台和方向。目前，在兽医学领域的各方面都应用较少，但是 RNAscope 技在医学领域的成功推广提示着该技术也将为兽医学领域带来一场技术的革命。
【参考文献】
相关期刊论文 前3条
1 周磊;杨汉春;姜平;童光志;闫恒普;;猪繁殖与呼吸综合征综合防控技术与应用[J];中国畜牧杂志;2015年06期
2 杨汉春;;主要猪病流行现状、防控面临的问题与对策[J];兽医导刊;2014年11期
3 孙广力;蔡雪辉;郑世民;孙刚;荣福龙;;猪繁殖与呼吸综合征病毒在猪动脉血管内皮细胞上的培养特性[J];中国兽医科学;2010年10期
本文编号：2746285
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