奶牛乳房炎致病菌生物被膜形成机制研究

发布时间：2020-07-10 01:12

【摘要】：奶牛乳房炎是奶牛乳腺组织因细菌感染、外伤或化学刺激所引起的乳房炎症,给奶牛养殖业造成重大的经济损失。已报导约有150种病原菌与奶牛乳房炎相关,90%以上病例主要因葡萄球菌、大肠杆菌和链球菌感染导致,其中葡萄球菌占到约50%。奶牛乳房炎致病菌往往都有形成生物被膜的能力,吸附于物体表面固着生长的细菌群体通常被称作“生物被膜”,致病菌生物被膜通常与许多持续性和慢性感染性疾病有关。当致病菌形成生物被膜之后,可在一定程度上逃避免疫系统的攻击从而很难被宿主清除,抗生素虽然可以减缓生物被膜细菌产生的致病性影响,但是由于其不能有效地作用于生物被膜里层细菌,以至对于生物被膜引起的慢性感染难以根治。目前针对奶牛乳房炎致病菌生物被膜的研究尚不全面,本研究针对奶牛乳房炎致病金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生物被膜展开研究,探求上述细菌生物被膜的功能基因及调控机制,探索对生物被膜细菌有针对性的治疗药物前体分子,同时研究上述药物与抗生素联合使用的实验条件,以期为奶牛乳房炎致病菌的防治提供新的治疗思路及药物靶标。主要研究结果如下:1.乳糖和牛奶可以增强金黄色葡萄球菌分离株S.aureus DCM1和S.aureus DCM2的生物被膜的形成能力。荧光定量PCR实验表明,乳糖是通过上调PIA合成酶基因ica ABCD操纵子影响生物被膜的形成的。而牛奶除了上调PIA的合成,还上调了其它一些生物被膜相关蛋白的表达量。2.地榆醇提物显著抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株SA3的生物被膜的形成能力。在添加地榆醇提物之后,ica ABCD的转录水平有明显的下降,而ica R的转录水平会随着地榆的添加而升高,证明了地榆是通过影响ica R的转录来调控ica操纵子的。3.群体感应信号分子AI-2通过提高ica操纵子和一种生物被膜相关蛋白的编码基因bhp的转录来促进表皮葡萄球菌菌株RP62A的生物被膜的形成。此外,一些已知的与生物被膜相关的调控基因的转录水平的检测结果显示,只有ica R的转录水平随着AI-2的添加发生了较明显的变化,表明了AI-2主要是通过ica R依赖的途径影响生物被膜形成的。4.玉米须水提液通过提高ica操纵子的转录水平抑制MRSA菌的生物被膜的形成。此外,体外抑菌性实验结果表明,在生物膜生长状态下,玉米须水提液能够增强MRSA菌株对万古霉素的敏感性。5.槲皮素-银纳米颗粒(QA NPs)相比于槲皮素(Qe)和银纳米颗粒(Ag NPs)对大肠杆菌菌株ECDCM1具有更强的抑菌活性和抑制生物被膜形成的能力。荧光定量PCR实验结果表明,QA NPs是通过下调bcs A、csg A、fli C、fim A、mot A和wca F这些生物被膜相关基因的转录水平来抑制菌株ECDCM1的生物被膜的形成的。
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.61
【图文】：

生物被膜

图 1.1 生物被膜形成过程。Fig 1.1 bioformation of biofilm图注：图片引自 Paul Stoodley, Peg Dirckx, Center for Biofilm Engineering, Motana State University。生物被膜的形成与解离通常由环境中的压力条件引起，许多环境压力因子可触发细菌生物被膜的形成，例如细菌的密度，外部环境中的渗透压，铁离子浓度氧浓度等等，当细菌感受到这些压力因素之后，通过信号转导系统，将信号传递胞内，引起靶基因表达的变化从而形成生物被膜结构[65]。近年来有些研究者认为还有一些外源物的刺激也可能会导致细菌已经形成的生物被膜瓦解。其机理可能直接作用于生物被膜结构本身促其降解或者是通过信号转导途径使细菌自身实现降解生物被膜的降解调控，以此为出发点可以探寻那些针对生物被膜为靶标的新治疗药物或者抗生素的辅助药物[17, 66]。1.4.4 生物被膜的致病性表现对于病原菌来说，形成生物被膜可能有助于其致病性的增强。生物被膜细菌

生物被膜,金黄色葡萄球菌,定殖,扫描电镜

生物被膜还含有细菌分泌的大分子多聚物、吸附的营养物质和代谢产物及细胞裂解产物等[86, 87]（图1.2）。成膜基因的表达是生物被膜形成的先决条件，已知金黄色葡萄球菌中主要的生物被膜基因为 ica operon，它是由 4 个基因 icaA、icaB、icaC、icaD 组成的基因簇，4 个基因共转录，负责转录 PIA 合成的功能基因，大部分金黄色葡萄球菌的生物被膜形成的前提就是 ica operon 的正常表达[1, 88]，然而近年来也有报道，有些金黄色葡萄球菌的生物被膜形成是 PIA 非依赖的，它们可能通过以分泌到胞外的蛋白组分为主体构建其生物被膜，一些表面蛋白的合成基因的表达可能与其生物被膜的形成密切相关，例如 bap

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到TSB培养基中，并且终浓度分别被调节到0%、0.1%、0.2%和0.4%。细胞培养物被转移到96孔培养板中继续培养，经过结晶紫染色，最终我们观察到了不同条件下的细菌生物被膜形成量。如图2.1A所示，在奶牛源金黄色葡萄球菌分离株S. aureus DCM1和S. aureus DCM2中，加入乳糖或者牛奶均会引起生物被膜形成量的明显增加，而人源金黄色葡萄球菌分离株S. aureus NCTC8325并不会受到影响。此外，我们用酶标仪检测了生物被膜的形成量，检测结果表明在菌株S. aureus DCM1和S. aureus DCM2中，随着乳糖或牛奶添加量的增加，生物被膜的形成量会有相应程度的增加（图2.1B）。因为加入牛奶或者乳糖所引起的生物被膜形成量的增加程度大致相同，因此我们猜测乳糖是牛奶当中主要影响生物被膜形成的组分。

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