猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白原核表达与鉴定

发布时间：2020-07-12 22:29

【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)引起的病毒性传染病。1995年,我国第一次暴发PRRS在北京郊区,2006年,由PRRS经典毒株突变株引起的高致病性猪繁殖与呼吸综合征(High pathogenic porcine reproductive and respiratory disease,HP-PRRS)迅速蔓延全国。主要临床表现为育肥猪和仔猪感染后的呼吸道症状,妊娠母猪感染后出现流产、早产、死胎和流产后发情不规则等,严重危害生猪养殖业的发展。本实验通过对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)的GP4基因进行原核表达,构建SUMO原核表达系统,诱导表达获得可溶性GP4蛋白。根据GenBank中PRRSV GP4基因设计特异性引物,酶切位点为BamHI、XhoI,片段大小约为537bp,从HN07-1株的细胞毒中提取病毒总RNA,反转录cDNA,将目的基因连接、转化至克隆载体pMD19-T,构建重组质粒pMD19-T-GP4。将测序正确的GP4基因和表达载体pET-28a-SUMO连接,构建重组表达载体pET-28a-SUMO-GP4。把pET-28a-SUMO-GP4重组表达载体转化到BL21(DE3)宿主菌中,在25℃0.6mmol/L的IPTG条件下,诱导6h,超声波破碎处理样品,对重组蛋白SUMO-GP4进行可溶性分析,经SDS-PAGE电泳检测分析,结果显示,重组蛋白SUMO-GP4以可溶性的形式表达,大小约为33kDa。利用Ni-NTA柱纯化重组蛋白SUMO-GP4,纯化后目的蛋白经SDS-PAGE电泳、Western-blot检测分析,在33kDa处有目的条带出现,且该重组蛋白能与猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清发生特异性反应。用SUMO蛋白酶水解纯化后的重组蛋白,去掉SUMO蛋白酶标签,获得目的蛋白GP4,通过Ni-NTA柱对目的蛋白GP4进行纯化,经SDS-PAGE电泳、Western Blot检测分析,得到一条大小约为19kDa的目的条带,与预期结果相一致,该目的蛋白具有较好的特异性,为PRRSV的检测和预防奠定了一定的基础。
【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.651
【图文】：

PCR扩增,组蛋白,目的,基性

2-12 Protein cleavage reaction system of target pro分（composition）体积（组蛋白 SUMO-GP4 1000MO Protease Buffer 20.0SUMO 蛋白酶 2.0μddH2O 定容至 1总体积 1000.CR 结果A 作为 PCR 的模板，对 GP4 全长目的基性目的条带被扩增出来，大小约为 537b

菌液,PCR扩增,阴性,载体

图 2-2 pMD-19-T-GP4 的菌液 PCR 扩-2 PCR production of pMD-19-T- GP4 准；1-2：pMD-19-T-GP4 的 PCR 扩: pMD-19-T-GP4 gene fragment by PCcontrol 图 2-1 GP4 的 PCR 扩增结果Fig 2-1 PCR production of GP4 gene-4：GP4 的 PCR 扩增产物；5：GP4 阴性4 gene fragment by PCR；5：GP4 Negative组载体双酶切鉴定结果P4 经 BamHI、XhoI 双酶切后，

重组克隆,质粒,菌液,阴性

2 pMD-19-T-GP4 的菌液 PCR 扩增R production of pMD-19-T- GP4 p1-2：pMD-19-T-GP4 的 PCR 扩-19-T-GP4 gene fragment by PCRtrol 图 2-1 GP4 的 PCR 扩增结果 2-1 PCR production of GP4 geneP4 的 PCR 扩增产物；5：GP4 阴性对e fragment by PCR；5：GP4 Negative 载体双酶切鉴定结果 BamHI、XhoI 双酶切后，

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