百里香酚抗小鼠金黄色葡萄球菌肺炎的药效学评价

发布时间：2020-07-21 14:40

【摘要】：金黄色葡萄球菌(金葡菌)为革兰氏阳性菌,是一种人兽共患病病原,能引起人和动物的多种疾病。金葡菌的致病性主要依靠表面蛋白、外分泌蛋白和多种酶。α-溶血素(Hla)是一种重要的外分泌蛋白,大量的研究表明Hla在金葡菌某些疾病的致病过程中起非常关键的作用,尤其是金葡菌性肺炎、乳房炎和角膜炎。以Hla为靶标在抗金葡菌肺炎过程中具有重要意义,为此我们从体外溶血实验中筛选出具有抗Hla作用的百里香酚,然后从百里香酚对金葡菌Hla表达的影响、百里香酚对金葡菌Hla介导的肺癌上皮细胞A549损伤的保护作用、百里香酚对小鼠的急性毒性研究和百里香酚对小鼠金葡菌肺炎模型的保护作用的四个角度对小鼠金葡菌肺炎进行药效学评价。本文进行了以下研究:1)通过测定最小抑菌浓度(MIC)、绘制生长曲线、检测溶血活性、蛋白免疫印迹分析和荧光定量PCR(RT-PCR)研究百里香酚在体外对金葡菌Hla表达的影响。2)通过live/dead实验和乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试验研究百里香酚对金葡菌Hla介导的肺癌上皮A549细胞损伤的保护作用。3)观察小鼠腹腔注射百里香酚后的临床症状,并通过Bliss法计算百里香酚对小鼠的半数致死量(LD_(50))。4)通过小鼠感染金葡菌的致死性保护率实验、组织病理学观察、肺湿重/干重(W/D)比和肺菌落计数研究百里香酚对小鼠金葡菌肺炎损伤的保护作用。结果:百里香酚对金葡菌的不同菌株的MIC范围为128-256μg/mL;百里香酚在0-32μg/mL浓度下对金葡菌USA300的生长没有影响;百里香酚具有抑制菌上清溶血的作用且呈一定的浓度依赖性,在浓度为32μg/mL时,金葡菌USA300的溶血活性降至34.8%,差异极显著(p0.01);在蛋白免疫印迹中百里香酚随着浓度的增加条带也是变弱的与溶血实验结果基本一致;金葡菌USA300 hla和RNAⅢ的转录水平随着药物浓度的增加而降低,当百里香酚浓度为32μg/mL时,与对照组相比hla和RNAⅢ的转录水平分别下降到5.5%和10.5%,差异极显著(p0.01)。在金葡菌USA300与A549细胞共培养体系中,随着百里香酚浓度的增加,细胞死亡率减少,当浓度为32μg/mL时LDH的释放量为4.8%,差异极显著(p0.01)。小鼠经腹腔注射百里香酚后,临床表现为:精神沉郁,活动减少,身体抽搐,甚至死亡,其临床症状随着剂量的增加而变得更严重。百里香酚通过腹腔注射对小鼠的半数致死量(LD_(50))为608.246 mg/kg,其95%的可信区间为500.149~807.214 mg/kg。百里香酚给药组与阳性对照组(只感染8325-4组)相比,能显著减少小鼠的死亡率(p0.05);观察肺脏解剖病理学和组织病理学的特征,发现给药组与阳性对照组相比肺部病理变化明显减轻;给药组与阳性对照组相比W/D值明显降低(p0.05)。给药组与阳性对照组相比肺脏菌落数明显降低(p0.01),菌落计数分别为:1.1×10~5 CFUs/mg和6.8×10~7 CFUs/mg。结论:百里香酚通过下调hla和RNAⅢ的转录水平而使Hla的表达下降;百里香酚对金葡菌USA300 Hla介导的肺癌上皮细胞A549的损伤具有保护作用;百里香酚对小鼠具有轻度毒性;百里香酚对小鼠金葡菌肺炎具有保护作用。该药将有望成为治疗金葡菌肺炎的新型药物。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S853.74
【图文】：

金葡菌,成孔,机制,致病过程

Song LZ et al., 1996, Science[8];B, Mc Gillivray DJ et al., 2009, Biophys J[17]）图 1 金葡菌 α-溶血素七聚体结构以及成孔机制A. Hla 七聚体，B. Hla 其具体插入脂质双分子层Fig. 1 Molecular graphics representation of the staphylococcal Hla and the heptameric porein the lipid bilayerA. Hla heptamer 232.4 KD. B. Membrane insertion of the heptametic pore.有研究发现 Hla 在金葡菌致病过程中发挥了巨大的作用。Bubeck 等人[18]研究表明 α-溶血素基因缺失株对小鼠的致死率显著降低，并未引起肺脏的损伤，该结果提示 α-溶血素可导致肺部损伤，并参与肺菌落定殖和免疫逃避。Bartlett 等人[19]研究结果表明 α-溶血素在金葡菌肺炎致病过程中可促进嗜中性粒细胞的产生和炎症细胞因子的释放并加重肺部炎症的病理变化。在 Mcelroy 的研究结果发现 α-溶血素间接作用于肺泡Ⅰ型上皮细胞，引起该细胞损伤，从而导致肺气血屏

示意图,金葡菌,示意图,葡萄球菌激酶

（Bronner S et al., 2004, FEMS Microbiol Rev[25]）图 2 金葡菌 Hla 基因调控网络示意图Fig. 2 Schematic figure showing how the expression ofhla is regulated in S. aureus by multiple interactions between regulatory factorsNote：Green and red arrows indicate positive and negative regulation, respectivelyAgr 系统是金葡菌致病因子最主要的调控系统，它受环境信号的影响如细菌密度、营养状态和能量利用率[26, 27]。Agr 系统调控着金葡菌重要的毒素（α-，β-和 γ-溶血素，TSST-1，肠毒素 B 以及 PVL）和各种酶（丝氨酸蛋白酶，V8 蛋白酶，葡萄球菌激酶，甘油酯水解酶，核酸酶，脂肪酶，PI-磷脂酶 C 和纤维蛋白溶酶）[28-33]。Dunman 等[34]人通过 Agr 突变基因的转录分析验证了 Agr 系统的作用。其中 RNAII 和 RNAIII 是金葡菌 Agr 系统的两大核心组成部分，如图 3 所

调控系统,转录水平

再通过 AgrB 将其排除，最终形成 AIP。在阈值浓度下， AgrC 与 AIP 结合后进行自磷酸化，形成 AgrA，从而激活 P2 和 P3 启成 RNAIII[35]。这将导致 RNAIII 的转录水平上调从而使毒素和酶的表达溶血素、蛋白酶、脂肪酶、肠毒素和 TSST-1，于此同时 AgrA 与启动子增加了 RNAII 的转录水平，为 agrB、agrD、agrC 和 agrA 操纵子创造反馈环[37]。此外，AgrA 还可以从两个启动子中调控酚可溶性蛋白（PS录和表达[38]。

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