牦牛脂肪分化相关miRNAs的筛

发布时间：2017-03-30 14:14

  本文关键词：牦牛脂肪分化相关miRNAs的筛选、表达及其靶基因分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：牦牛主要分布在青藏高原及其毗邻的高海拔区域,是当地牧民的主要肉食来源。特殊的环境和饲养方式形成了独特的肉品质,也造成了牦牛夏壮、春乏的生长规律,而脂肪分化对于脂肪的形成具有重要影响,脂肪细胞分化进程由多个信号通路参与复杂生物过程,miRNA对于脂肪分化也有不同程度的调节,但具体的调控机制至今尚不明确。为更好的解析牦牛脂肪分化的调控机制,本论文运用生物信息学方法预测出牦牛脂肪分化相关候选miRNAs,并分析候选miRNAs的组织间表达差异,运用TargetScan和STRING在线软件筛选出候选miRNAs的相应靶基因并对其进行功能分析,采用双荧光素酶报告基因系统对得到的候选靶基因进行验证,主要结果如下：1.牦牛脂肪分化相关miRNAs的筛选首先找出可能调控普通牛脂肪分化的miRNAs,将其同牦牛核苷酸序列进行blast比对,运用Mfold预测所得pre-miRNA的二级结构,得到bta-miR-2340、 bta-miR-1260b、bta-miR-22-5p、bta-miR-2328-3p、bta-miR-1777b和bta-miR-1388-5p共5个miRNAs可能参与牦牛脂肪分化调控。2.候选miRNAs组织间差异表达分析对预测得到的5个miRNAs基于心、脾、肺、肾、背最长肌和皮下脂肪6个组织进行表达差异分析。结果显示,脂肪组织,肝脏组织和胰脏组织作为脂质代谢的主要组织,bta-miR-2328-3p、bta-miR-1388-5p和bta-miR-22-5p相较其他组织在脂肪组织中表达量均较低,可能主要参与其他调节并非调控脂肪分化；而bta-miR-2340、bta-miR-1777b和bta-miR-1260b在脂肪组织中表达量相对较高,可能参与调控脂肪分化过程。3.候选miRNAs靶基因的预测和功能分析运用TargetScan对筛选得到的miRNA包括bta-miR-2340、bta-miR-1777b和bta-miR-1260b进行相应靶基因的预测。bta-miR-2340和bta-miR-1777b分别预测得到131和49个靶基因,而bta-miR-1260b无预测结果。使用STRING在线软件对bta-miR-2340靶基因进行功能分析,候选靶基因BAD、CHRM1、IRAK1、 SOCS3和FOXO4主要参与脂肪分化相关信号通路,推测上述基因可能为bta-miR-2340的靶基因。4. bta-miR-2340候选靶基因的组织间差异表达分析运用RT-PCR对bta-miR-2340候选靶基因进行心、脾、肺、肾、背最长肌和皮下脂肪组织的表达差异分析,结果显示BAD和IRAK1整体表达量较高。其中BAD在心中高丰度表达,脂肪中次之。CHRM1同在脂肪中相比肾中表达量较高。IRAKI在心和脾中表达量高,其他组织较低。SOCS3在肺和脂肪中表达量较高。FOXO4心和背肌组织中表达量较高,其他组织均较低。但CHRM1和FOXO4整体表达均很低。5. bta-miR-2340靶基因的验证采用双荧光素酶报告基因系统对bta-miR-2340靶基因进行验证。分别构建BAD、CHRM1、IRAK1、SOCS3和FOXO4与psiCHECK-2载体的重组质粒,并在bta-miR-2340 mimics和脂质体2000存在的条件下转染到Hela细胞。与对照组相比最终结果显示bta-miR-2340 mimics可降低BAD突变型活性,对于CHRM1、IRAK1、SOCS3和FOXO4突变型均无任何影响,对于CHRM1野生型也无任何影响,然而可增加IRAKI和FOXO4野生型荧光活性,只有SOCS3野生型荧光活性下降且突变组荧光活性无影响,但只下降20%不符合前人所述30%,推测bta-miR-2340可能均不作用于以上位点。
【关键词】：牦牛 脂肪分化 miRNAs 靶基因 差异表达
【学位授予单位】：西北民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823.85
【目录】：

• 摘要5-7
• abstract7-9
• 缩略词表9-13
• 第1章 文献综述13-27
• 1.1 脂肪细胞分化概述13-22
• 1.1.1 脂肪细胞分化过程13
• 1.1.2 脂肪组织分类13-14
• 1.1.3 调控脂肪分化的主要信号通路14-17
• 1.1.3.1 Wnt/β-catenin信号通路14-15
• 1.1.3.2 TGF-β信号通路15-16
• 1.1.3.3 MAPK信号通路16
• 1.1.3.4 FGF信号通路16-17
• 1.1.3.5 Hedgehog信号通路17
• 1.1.3.6 胰岛素/IGF1信号通路17
• 1.1.4 调控脂肪分化的关键转录因子17-20
• 1.1.4.1 PPARs17-19
• 1.1.4.2 C/EBPs家族19
• 1.1.4.3 SREBP家族19-20
• 1.1.5 调控脂肪组织和肌内脂肪代谢关键基因研究进展20-22
• 1.1.5.1 LPL21
• 1.1.5.2 LRP621
• 1.1.5.3 AP221-22
• 1.1.5.4 FAS22
• 1.1.5.5 SOCS322
• 1.2 miRNA的研究进展22-26
• 1.2.1 miRNA的发现及形成机制22-23
• 1.2.2 动物miRNA的作用机制23-24
• 1.2.3 miRNA的鉴定方法24-25
• 1.2.3.1 直接克隆法24
• 1.2.3.2 生物信息学法24-25
• 1.2.3.3 其他方法25
• 1.2.4 调控脂肪分化miRNA的研究进展25-26
• 1.3 本研究的目的及意义26-27
• 第2章 牦牛脂肪分化相关miRNA的预测与表达分析27-39
• 2.1 实验材料27-28
• 2.1.1 实验动物样品采集27
• 2.1.2 主要仪器设备27
• 2.1.3 主要试剂27
• 2.1.4 数据采集27-28
• 2.2 实验方法28-31
• 2.2.1 miRNA生物信息学预测28
• 2.2.2 组织总RNA提取28-29
• 2.2.3 引物设计29
• 2.2.4 RNA反转录29-30
• 2.2.5 PCR分析30
• 2.2.6 RT-PCR分析30-31
• 2.3 结果和分析31-35
• 2.3.1 候选牦牛与脂肪分化相关miRNA31-34
• 2.3.2 牦牛各组织总RNA提取结果34
• 2.3.3 候选miRNA的RT-PCR分析34-35
• 2.4 讨论35-38
• 2.5 小结38-39
• 第3章 牦牛miRNA靶基因的预测、功能及表达分析39-45
• 3.1 实验材料39
• 3.1.1 主要软件39
• 3.1.2 主要仪器设备及试剂39
• 3.2 实验方法39-40
• 3.2.1 miRNA靶基因预测及功能分析39
• 3.2.2 miRNA靶基因表达引物设计39
• 3.2.3 cDNA合成及实时荧光定量PCR39-40
• 3.3 结果和分析40-43
• 3.3.1 miRNA靶基因预测和功能分析40-42
• 3.3.2 miRNA候选靶基因RT-PCR分析42-43
• 3.4 讨论43-44
• 3.5 小结44-45
• 第4章 bta-miR-2340靶基因的验证45-53
• 4.1 实验材料45
• 4.1.1 主要试剂与仪器45
• 4.2 实验方法45-49
• 4.2.1 靶基因克隆和载体构建引物设计45-46
• 4.2.2 靶位点PCR扩增和回收46
• 4.2.3 T克隆测序46-48
• 4.2.4 双酶切和重组载体构建48
• 4.2.5 Hela细胞的培养48-49
• 4.2.6 细胞转染49
• 4.2.7 双荧光素酶报告系统检测49
• 4.3 结果和分析49-51
• 4.3.1 野生型和突变型质粒构建50
• 4.3.2 双荧光素酶报告系统检测50-51
• 4.4 讨论51-52
• 4.5 结论52-53
• 结论53
• 创新点53
• 进一步研究内容53-54
• 参考文献54-65
• 致谢65

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