长非编码RNA-AK394747在猪骨骼肌卫星细胞增殖及分化过程中的作用研究

发布时间：2020-08-06 18:31

【摘要】：骨骼肌卫星细胞是一类位于肌纤维膜表面与基底膜之间的细胞,在肌肉的发育和再生过程中发挥着重要的作用。长非编码RNA(Long non coding RNAs,lncRNA)是一类转录本长度超过200nt,具有低蛋白编码潜力的RNA分子。lncRNA能够调控基因表达、参与表观遗传修饰,影响细胞增殖、分化和凋亡等多种生命活动的进程。本研究以体外分离的猪骨骼肌卫星细胞为材料,研究一个新的lncRNAAK394747在细胞增殖和分化过程发挥的功能及可能存在的机制。主要研究结果如下:1.利用两步酶消化法成功分离出活性较高、有一定增殖能力的猪原代骨骼肌卫星细胞,经差速贴壁纯化后,用Pax7基因对分离的细胞进行鉴定,免疫荧光结果显示细胞阳性率高达95%。同时,对分离的细胞进行分化诱导培养,能形成肌管,且稳定表达MyoD、MyoG和MyHc这三个成肌标志基因。2.通过RACE和测序验证了猪AK394747全长为1586bp,生物信息学分析发现该lncRNA不具有编码蛋白的能力,主要存在于细胞质中,时空表达谱分析表明AK394747在腿肌、背肌等肌肉组织中高表达,且随着猪骨骼肌细胞的分化表达量上升。3.在猪骨骼肌细胞中利用干扰和超表达实验研究了AK394747对细胞增殖和分化的影响,EdU、RTCA以及细胞周期检测等实验结果发现该lncRNA对骨骼肌细胞的增殖过程无显著影响,并且增殖相关基因ki67、N-Ras和CDK家族基因表达变化不显著;而干扰AK394747后,利用Q-PCR、Westren Blotting以及免疫荧光技术检测发现肌细胞分化标志基因MyoD、MyoG、MyHc等的mRNA和蛋白水平表达显著下降,表明AK394747促进了猪骨骼肌细胞分化。4.通过生物信息学筛选了4个潜在的与AK394747结合的miRNA—ssc-miR-32,ssc-miR-218,ssc-miR-218-3p,ssc-miR-301。在干扰AK394747后,其中ssc-miR-32及其pri-RNA表达降低。通过在线软件预测发现AK394747基因与NICD蛋白可能相互结合,同时利用Q-PCR技术检测发现干扰AK394747后NICD(Notch1胞内片段)基因的表达显著升高。本实验研究了猪lncRNA-AK394747的基本性质,验证了其促进骨骼肌细胞分化的基因功能,初步预测了其可能发挥作用的方式,为研究AK394747在骨骼肌细胞发育过程中的作用机制奠定了基础,同时也为研究猪骨骼肌生长发育调控机制提供了新的思路。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S828
【图文】：

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华中农业大学 2018 届硕士研究生学位（毕业）论文第二章材料与方法物白猪由华中农业大学精品猪场提供。体 X Competent 大肠杆菌（DH5α）购自台湾 YEASTER克隆的载体 pMD18-T Vector 购自 TaKaRa 公司，图谱

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etent 大肠杆菌（DH5α）购自台湾体 pMD18-T Vector 购自 TaKaRa 公图 2-1 pMD18-T 载体Fig.2-1 Circle map of pMD18-TNA3.1 由本实验室保存，图谱见下

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长非编码 RNA-AK394747 在猪骨骼肌卫星细胞增殖及分化过程中的作用研究第三章结果和分析1 猪骨骼肌细胞的分离与鉴定1.1 骨骼肌细胞的纯化与培养从第 1 天分离细胞开始，第 2 天细胞换液，第 4 天进行差速贴壁纯化获得原代猪骨骼肌卫星细胞。此后，每 4 天传一代。取第三代细胞接板于 6 孔板，待细胞长至 80%-90%密度后，更换分化培养基，诱导其分化形成肌管。观察可发现，分离的细胞在分化 3 天开始有肌管形成，在分化 6 天肌管形成明显增多（图 3-1），证明分离出的原代细胞具有分化形成肌管的能力。

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