猪丁型冠状病毒HB-BD株分离鉴定及生物学特性研究

发布时间：2020-08-14 20:28

【摘要】：猪丁型冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)是一种新发现的猪肠道病毒,可引起以水样腹泻、呕吐、脱水和仔猪死亡为特征的肠道疾病。2012年,PDCoV首次在我国香港被发现,随后该病于2014年在美国爆发。目前PDCoV在世界许多国家都被检测到,据报道,在我国的部分省份猪场中也检测到了PDCoV,该病毒已经成为严重影响养猪业健康发展的新发病原。本研究将RT-PCR检测为PDCoV阳性的腹泻样本接种ST细胞进行病毒的分离传代。通过观察其细胞病变,RT-PCR、病毒滴度的测定和间接免疫荧光的鉴定,结果成功分离到1株能在ST细胞上稳定增殖并能产生明显细胞病变(CPE)的猪丁型冠状病毒(HB-BD毒株)。通过RT-PCR对其全基因进行了扩增,除去3’端poly(A),基因组全长为25420 bp,基因结构为5’UTR-ORF1-S-E-M-NSP6-N-NSP7-3’UTR,每部分的碱基数分别为540 nt,18803 nt,3480 nt,252 nt,654 nt,285 nt,1029 nt,603nt和392 nt。全基因序列分析显示,HB-BD株与参考株之间的同源性为97.2%-99.5%,并与PDCoV/NH株之间的同源性最高(99.5%);进化树分析表明,HB-BD株与其他PDCoV参考株同属于δ冠状病毒属,并且与中国毒株的亲缘关系比美国、韩国和泰国毒株近。以纯化的重组PDCoV S1蛋白作为包被抗原,通过对反应条件进行优化后,建立了检测猪血清中PDCoV IgG抗体的间接ELISA方法。优化结果显示,该方法的抗原最佳包被浓度为1.0μg/mL,血清稀释倍数为1∶200,封闭液为含5%胎牛血清的PBST工作液。酶标抗体最佳稀释度为1∶20000。一抗和二抗的孵育时间均为37℃作用1 h;底物显色时间为15 min。通过30份阴性血清,得出阴阳性临界值为0.369。特异性试验表明,该方法不与PEDV、TGEV、PCV2、PRV、CSFV、PRRSV等常见猪病毒阳性血清发生交叉反应;重复性试验表明,批内和批间重复性试验的变异系数都小于10%,具有较好的特异性和重复性。ROC曲线分析得出,与western blot相比,该方法的敏感性和特异性分别为100%和92.3%。上述试验结果表明,本研究建立的重组S1蛋白间接ELISA方法具备检测PDCoV抗体的可行性。应用建立的间接ELISA方法,对2017年1月至2017年12月份收集的来自河北部分地区的542份猪血清样品进行检测,样本阳性率为18.6%。鉴于目前尚无有效的治疗方法或疫苗可用于控制PDCoV。本研究为探讨依靠RNA干扰(RNAi)技术对PDCo V体外增殖的抑制作用,分别构建了针对PDCoV的M和N基因的两个shRNA表达质粒(p Genesil-M和pGenesil-N),并转染入ST细胞,进行基因干扰实验研究。分别对转染组和对照组进行TCID_(50)检测,以及对CPE进行观察和荧光定量PCR检测,测定结果表明两种shRNA表达质粒(pGenesil-M和pGenesil-N)均能够抑制PDCoV在ST细胞上的增殖,且pGenesil-N表达质粒的抑制率要高于pGenesil-M表达质粒。综上所述,本研究对PDCoV HB-BD毒株进行了分离鉴定以及全基因序列分析,并根据S1蛋白建立了间接ELISA方法,对2017年河北省部分地区的血清样本进行了检测,以及对RNAi技术抑制PDCoV体外增殖进行了研究。本研究为PDCoV的遗传进化、致病性等研究奠定了基础,也在流行病学调查、疾病的诊断、疫苗的研制和防治工作方面具有重要意义。
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.651

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