TLR4基因在绵羊胚胎附植期子宫内膜的表达模式研究
发布时间：2020-08-15 17:30
【摘要】：养羊业是我国畜牧产业经济发展的重要组成部分,其繁殖力、羔羊出生率等直接关系到牧民的经济收入。为了畜牧业的发展,越来越多的核移植、胚胎移植等技术早已应用到生产实践上来,但这些技术的发展又存在胚胎着床率低下的问题,是一个复杂的生理过程,也是妊娠建立的一个关键环节。TLR4是近几年研究次数最频繁、领域最广泛的基因,与LPS配体结合能够激活TLR4信号传导通路,引起下游各种炎症因子与激素的释放,并能够相互作用调控细胞的许多功能,可能涉及哺乳动物胚胎附植,所以有关胚胎附植基因表达的研究也成为了热点。目的:本实验通过研究TLR4在绵羊胚胎附植期子宫内膜上的表达模式,从细胞水平上验证TLR4对附植的影响机制,为提高胚胎附植率提供借鉴。方法:本实验首先运用半定量RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR分别检测21 d妊娠绵羊全身组织和妊娠第9 d、13 d、17 d、21 d、25 d绵羊子宫内膜组织中TLR4基因的表达。其次,通过免疫组织化学和细胞免疫学抗体着色法检测TLR4蛋白在早期妊娠绵羊(9 d、13 d、17 d、21 d、25 d)子宫组织中的分布与表达,并利用VIM蛋白特异性检测基质细胞的完整性。最后,进行构建pcDNA3.1(+)-TLR4真核表达载体,用1μg·L~(-1)的LPS刺激转染后的子宫内膜基质细胞,建立内膜基质细胞炎症模型。利用荧光定量RT-PCR技术和蛋白质免疫印迹Western Blot方法检测受LPS刺激后的内膜基质细胞TLR4 mRNA表达量和TLR4蛋白表达量以及免疫因子IL-1β和IL-6的mRNA表达水平。结果:不仅发现TLR4基因在绵羊全身组织的输卵管、卵巢、子宫、膀胱、脾脏及松果体中表达量较高,在肝脏、小肠、肌肉中表达较弱,而在心脏、垂体、脂肪等组织中不表达,而且TLR4基因在子宫内膜中的表达量从第9 d开始下降至附植点第17 d最低,之后上升到第25 d达到峰值。此外,TLR4基因不管是在中国美利奴羊还是在湖羊子宫内膜组织中检测,其黄体期的表达水平均显著高于卵泡期(P0.05)。其次,TLR4蛋白在子宫内膜各部位均有表达,呈一定的动态时空模式,且在第17 d的基质细胞中表达尤为显著,并鉴定出基质细胞的完整性。最后成功构建pcDNA3.1(+)-TLR4真核表达载体,并且发现LPS不仅降低了细胞中IL-6的表达,增加了IL-1β的表达,引起炎症反应,使Th1/Th2偏向不利于妊娠的Th1方向,而且TLR4 mRNA表达量在12 h、24 h、48 h、72h显著高于对照组(P0.05),其中48 h的表达极显著(P0.01),TLR4蛋白表达量也始终高于对照组,与定量结果一致。结论:TLR4的表达具有组织特异性,且在绵羊胚胎附植期及发情周期的子宫内膜中呈现一定规律,提示TLR4在绵羊繁殖期发挥一定作用。发现TLR4蛋白在胚胎附植早期子宫内膜中的表达模式。LPS有效激活了子宫内膜细胞中TLR4信号通路;子宫蜕膜组织TLR4受体蛋白对胚胎附植早期妊娠微环境的平衡维持起重要作用。
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S826
【图文】：
TLR4 基因在绵羊胚胎附植期子宫内膜的表达模式研究大多数 TLRs 信号传导中有着重要的作用。例如在 TLR2、TLR5、TLR7、TLR9[13]传导途径中，若有 MyD88 衔接蛋白的缺陷就会导致信号传导受阻。而 TLR3 和 TL两个比较特殊的 Toll 样受体，TLR3 主要介导 MyD88 非依赖型信号转导通路，当yD88 也可以在 TLR3 的负调节中发挥功能[14]，TLR4 则可以同时介导这两种传导途如图 1）。两种不同的信号传导途径通过不同的通路，分别经过一系列的信号传导链 NF-kB，AP-1 或 IRF-3 等转录因子，最后进入细胞核调节炎症因子、细胞因子、共分子和细胞增殖、凋亡等基因的表达，从而启动先天性免疫和获得性免疫系统[15]。
图 2 非侵入型胚胎附植的时期变化Figure 2 Non-invasive implantation of non-decidualizing species我们以绵羊胚胎为例，它的附植过程也大致分为囊胚的孵化、自身的伸长、与子宫细胞的附植预接触，还有胚胎的定位与黏附等几个阶段。而囊胚的孵化就标志着胚母体子宫的一种分子对话，开始密切的信号联系。通常在妊娠第6 d形成胚泡，第8 d突破透明带孵出，胚胎便吸取滋养层细胞的营养剧烈生长，发生形态学变化。妊娠1 d由球形变为管形，到第12 d时长度可达10~22 mm，到17 d已达15 cm以上[45]。其中的第14 d，第一次出现双核细胞，它是胚胎附植的典型标志之一。但其功能尚未完楚，可能与合成催乳素、类固醇激素、妊娠蛋白等物质有关（图3）。另外，在绵羊的第13 d胚胎伸长的过程中滋养层细胞可形成指状形突起，紧接着第14-15 d定位并附着于子宫，并在第17 d左右发生黏附附植，绒毛不断生长至血管生成。同时合成妊娠蛋白、类固醇激素等物质来调节母体生理内环境，至妊娠第21 d附植基本完成。至第30 d胚胎滋养层绒毛与子宫阜的组织形成“母包子型”胎盘[46]，指状突起也随之。
其中妊娠的第14 d，第一次出现双核细胞，它是胚胎附植的典型标志之一。但其功能尚未完全清楚，可能与合成催乳素、类固醇激素、妊娠蛋白等物质有关（图3）。另外，在绵羊妊娠的第13 d胚胎伸长的过程中滋养层细胞可形成指状形突起，紧接着第14-15 d定位并初步附着于子宫，并在第17 d左右发生黏附附植，绒毛不断生长至血管生成。同时合成分泌妊娠蛋白、类固醇激素等物质来调节母体生理内环境，至妊娠第21 d附植基本完成。随后至第30 d胚胎滋养层绒毛与子宫阜的组织形成“母包子型”胎盘[46]，指状突起也随之消失。图 3 绵羊胚胎附植迁移模式及与母体血浆激素水平Figure 3 Migration model and plasma hormone levels in ovine embryo implantation
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S826
【图文】：
TLR4 基因在绵羊胚胎附植期子宫内膜的表达模式研究大多数 TLRs 信号传导中有着重要的作用。例如在 TLR2、TLR5、TLR7、TLR9[13]传导途径中，若有 MyD88 衔接蛋白的缺陷就会导致信号传导受阻。而 TLR3 和 TL两个比较特殊的 Toll 样受体，TLR3 主要介导 MyD88 非依赖型信号转导通路，当yD88 也可以在 TLR3 的负调节中发挥功能[14]，TLR4 则可以同时介导这两种传导途如图 1）。两种不同的信号传导途径通过不同的通路，分别经过一系列的信号传导链 NF-kB，AP-1 或 IRF-3 等转录因子，最后进入细胞核调节炎症因子、细胞因子、共分子和细胞增殖、凋亡等基因的表达，从而启动先天性免疫和获得性免疫系统[15]。
图 2 非侵入型胚胎附植的时期变化Figure 2 Non-invasive implantation of non-decidualizing species我们以绵羊胚胎为例，它的附植过程也大致分为囊胚的孵化、自身的伸长、与子宫细胞的附植预接触，还有胚胎的定位与黏附等几个阶段。而囊胚的孵化就标志着胚母体子宫的一种分子对话，开始密切的信号联系。通常在妊娠第6 d形成胚泡，第8 d突破透明带孵出，胚胎便吸取滋养层细胞的营养剧烈生长，发生形态学变化。妊娠1 d由球形变为管形，到第12 d时长度可达10~22 mm，到17 d已达15 cm以上[45]。其中的第14 d，第一次出现双核细胞，它是胚胎附植的典型标志之一。但其功能尚未完楚，可能与合成催乳素、类固醇激素、妊娠蛋白等物质有关（图3）。另外，在绵羊的第13 d胚胎伸长的过程中滋养层细胞可形成指状形突起，紧接着第14-15 d定位并附着于子宫，并在第17 d左右发生黏附附植，绒毛不断生长至血管生成。同时合成妊娠蛋白、类固醇激素等物质来调节母体生理内环境，至妊娠第21 d附植基本完成。至第30 d胚胎滋养层绒毛与子宫阜的组织形成“母包子型”胎盘[46]，指状突起也随之。
其中妊娠的第14 d，第一次出现双核细胞，它是胚胎附植的典型标志之一。但其功能尚未完全清楚，可能与合成催乳素、类固醇激素、妊娠蛋白等物质有关（图3）。另外，在绵羊妊娠的第13 d胚胎伸长的过程中滋养层细胞可形成指状形突起，紧接着第14-15 d定位并初步附着于子宫，并在第17 d左右发生黏附附植，绒毛不断生长至血管生成。同时合成分泌妊娠蛋白、类固醇激素等物质来调节母体生理内环境，至妊娠第21 d附植基本完成。随后至第30 d胚胎滋养层绒毛与子宫阜的组织形成“母包子型”胎盘[46]，指状突起也随之消失。图 3 绵羊胚胎附植迁移模式及与母体血浆激素水平Figure 3 Migration model and plasma hormone levels in ovine embryo implantation
【参考文献】
相关期刊论文 前10条
1 张谊;何自标;陈晨;鲜红;张明;;TLR4在妊娠异常终止中的作用机制和研究进展[J];中国畜牧兽医;2014年07期
2 王玉华;;子宫内膜癌发病相关因素及治疗进展[J];医学理论与实践;2013年05期
3 熊q试
本文编号：2794423
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/2794423.html
