猪δ冠状病毒辅助蛋白的鉴定及NS6抑制IFN-β产生的机制研究

发布时间：2020-08-15 21:25

【摘要】：冠状病毒(Coronavirus,CoV)属于套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae),其感染宿主范围十分广泛,包括鸟类、人以及其他哺乳动物。根据国际病毒分类委员会第九次报告,冠状病毒可分为α、β、γ、δ4个属。在冠状病毒编码的蛋白中,除了传统的结构蛋白和非结构蛋白,还存在数量不等、零散分布在结构蛋白之间或内部的辅助蛋白(accessory protein)。这些辅助蛋白具有种属特异性,与其他已知蛋白没有同源性或者同源性非常低。根据目前关于SARS-CoV等冠状病毒辅助蛋白的研究结果,证实冠状病毒辅助蛋白是病毒复制非必需的,但参与了免疫调控,并且与病毒的毒力相关。2014年美国首次报道猪场爆发猪δ冠状病毒(PDCoV),引起新生仔猪的腹泻、呕吐、死亡。随后,多个国家报道了该病的发生与流行,引起养猪业的高度关注。根据基因组序列预测PDCoV可编码两个辅助蛋白NS6和NS7,但没有得到实验验证,其功能也有待分析。另外,除了NS6和NS7外,PDCoV是否还编码其它的辅助蛋白也不清楚。因此,本研究以PDCoV CHN-HN-2014毒株为代表,对其假定编码的辅助蛋白进行鉴定,同时探究它们与宿主天然免疫反应之间的关系。具体研究内容如下:1.PDCoV辅助蛋白NS6的鉴定参照PDCoV CHN-HN-2014全基因组序列,设计两条特异性引物(Leader-F,NS6r),分别位于基因组5'端前导序列以及NS6基因3'末端。提取病毒感染的细胞总RNA,进行RT-PCR和测序分析,结果显示NS6是一个独立的亚基因组(subgenomic RNA,sgmRNA),采用了非经典的调控序列(transcription regulating sequences,TRS),且位于预测的TRS上游。随后,通过单克隆抗体的制备成功获得两株稳定分泌NS6特异性抗体的杂交瘤细胞。间接免疫荧光(IFA)和Western blot分析表明:两株单抗(2G3和4B9)可特异性识别过表达的NS6蛋白或PDCoV感染的LLC-PK1细胞,证实NS6蛋白在病毒感染早期表达,而且定位于细胞质中。进一步分析发现,NS6蛋白主要定位于内质网和内质网高尔基体室,部分定位于高尔基体。这些结果首次证实了NS6蛋白在PDCoV感染细胞中的表达,而且NS6是一个独立的亚基因组,采用了非经典的TRS(ACACCT)。2.PDCoV辅助蛋白NS7的鉴定及NS7a的发现根据预测的PDCoV NS7的序列,设计引物将预测的NS7基因克隆至pGEX-KG原核表达载体中,获得重组质粒pGEX-KG-NS7。随后,经IPTG诱导表达获得GST-NS7融合蛋白,进一步通过单克隆抗体制备成功获得4株稳定分泌NS7蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞。IFA证实4株单克隆抗体都能特异性识别PDCoV感染的或过表达NS7的LLC-PK1细胞。Western blot分析发现,4株单克隆抗体与PDCoV感染的细胞反应时,除了能检测到NS7蛋白条带外,还出现了一条大小约12 kDa的特异性蛋白条带。但是,这个小蛋白条带在过表达NS7的细胞中并没有出现。随后,通过分析PDCoV感染细胞后病毒的亚基因组RNA,发现存在一条采用非经典TRS的新的亚基因组RNA,其ORF的3'末端与NS7 3'末端完全相同,可编码大小为100个氨基酸的多肽,说明可能存在一个新的辅助蛋白,将其命名为NS7a。进一步研究发现,过表达的NS7a蛋白能被4株针对NS7的单克隆抗体特异性识别,并且与病毒感染条件下检测到的较小的蛋白大小一致。这些结果表明PDCoV确实编码了一个新的辅助蛋白NS7a,是一个独立的亚基因组,而且采用了非经典的TRS(ACCCCA)。3.PDCoV辅助蛋白NS6拮抗IFN-β产生的机制先前的研究已经证实PDCoV编码了3个辅助蛋白(NS6、NS7、NS7a),但是这些辅助蛋白是否也具有免疫调节功能尚不清楚。因此,我们以NS6为代表对PDCoV辅助蛋白调控天然免疫的特性进行了进一步研究。将NS6克隆至pCAGGS-HA载体中获得真核表达质粒pCAGGS-HA-NS6,转染细胞进行超表达,发现NS6蛋白能显著抑制仙台病毒(Sendai virus,SeV)诱导的IFN-β启动子活性以及IFN-β蛋白表达,而且抑制SeV诱导的关键转录因子IRF3和NF-κB的磷酸化以及入核,表明NS6蛋白能够拮抗IFN-β产生。但令人惊奇的是,NS6蛋白对RLRs(RIG-I-like receptors)信号通路关键分子(RIG-I/RIG-IN、MDA5、MAVS、TBK1、IKKε、IRF3)介导的IFN-β启动子活性并没有抑制作用,提示NS6蛋白可能靶向RIG-I/MDA5或其上游。同时,通过免疫共沉淀实验(Co-IP)和IFA分析发现,NS6与RIG-I/MDA5存在相互作用,而且这种相互作用并不依赖于RNA;进一步分析表明,NS6蛋白与RIG-I的CTD区域以及MDA5的Hel和CTD区域发生相互作用,RNA pull-down分析证实NS6不是一个RNA结合蛋白。随后的Co-IP竞争性试验结果也证实NS6蛋白能显著减弱RIG-I/MDA5与dsRNA的结合。上述结果表明NS6采用了一种新的免疫抑制策略,抑制RLRs介导的IFN-β产生。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.651
【图文】：

冠状病毒,基因结构

猪冠状病毒辅助蛋白的鉴定及 NS6 抑制 IFN-β 产生的机制研究RdRp），对病毒负链 RNA 合成必不可少，另外有研究发现 nsp8 也能起始 RNA 的合成，其 C 端与病毒 RdRp 的催化活性区有一定程度的同源，可能作为引发酶合成引物供 RdRp 使用（Imbert et al 2006）。Nsp13 是超家族 1 解旋酶（Helicase, Hel），Nsp14 含有核酸外切酶活性（ Exonuclease, ExoN ）和 N7- 甲基转移酶活性（N7-Methyltransferase），Nsp15 具有核酸内切酶活性（Endonuclease, EndoU），而nsp16 含有 2'-O-甲基转移酶活性（2'-O-methyltransferase）。这些成熟的非结构蛋白参与病毒基因组的复制以及亚基因组（sgmRNA）的合成。另外，基因组 3'端编码病毒结构蛋白（S, E, M, N）以及零散分布在结构蛋白之间或内部的辅助蛋白。以TGEV 为代表的冠状病毒基因结构见图 1-2。

模式图,冠状病毒,模式,动脉炎病毒

反向遗传学技术研究证实前导序列的 TRS-L 与未成熟负链的 cTRS-B 碱基互补配对在动脉炎病毒和冠状病毒转录过程中是必不可少的步骤（Pasternak et al 2001,Zuniga et al 2004）。根据目前冠状病毒及动脉炎病毒转录过程的研究，有文献提出一种负链 RNA 不连续转录模式（图 1-4），主要包括三个步骤：1. 形成基因组 RNA

示意图,示意图,病毒,成员

尽管 RIG-I 与 MDA5 具有类似的结构，但是它们识别的病毒具有差异性。识别仙台病毒（Sendai virus, SEV）、新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV副黏病毒科成员(Fournier et al 2012, Martinez-Gil et al 2013, Jorgensen et al 2018病毒科成员，如日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）、丙型肝毒（Hepatitis C virus, HCV）以及弹状病毒科成员，如水泡性口炎病毒（Vesstomatitis virus, VSV）、狂犬病毒（Rabies virus，RV）和埃博拉病毒（Ebola virus, E（Saito et al 2008, Nazmi et al 2011, Schirrmacher 2015）。另外，RIG-I 还能识别DNA 病毒，包括腺病毒、牛痘病毒以及单纯疱疹性病毒（Herpes simplex virus, H（Crill et al 2015）。而 MDA5 识别小 RNA 病毒科成员，如脊髓灰质炎病毒、肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus, EMCV）、柯萨奇病毒（Gitlin et al 2006还有一些病毒同时能被 RIG-I/MDA5 识别，如登革热病毒（Dengue virus, DEN西尼罗病毒（West Nile virus, WNV）、鼠肝炎病毒（Mouse hepatitis virus, MH图 1-7 RLRs 功能域组成示意图（Wu et al 2014）Fig.1-7 The functional domain organization of RLRs

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