DnaK-TPR与LDH2基因在弓形虫生长发育中的功能与调控机制研究
发布时间：2020-08-26 13:58
【摘要】：弓形虫是一种专性细胞内寄生的机会性致病寄生虫,能够感染包括人在内的所有温血动物,在世界范围内广泛分布,可以引起严重的弓形虫脑病、眼病、流产、死胎等症状。弓形虫在中间宿主体内分为急性感染和慢性感染,急性感染阶段以速殖子形式快速繁殖,但在免疫力正常的宿主体内,速殖子可转化为缓殖子形式,形成组织包囊长期存在于宿主机体内造成慢性感染,目前没有任何慢性弓形虫病的治疗手段。一旦机体免疫力下降,包囊内的缓殖子会再活化为速殖子,再次造成宿主急性感染而导致严重的机体损伤甚至死亡。弓形虫速殖子与缓殖子相互转化是弓形虫传播与致病的关键所在,对弓形虫缓殖子形成的机制的研究将有助于阐明弓形虫生长发育的分子调控机理,为弓形虫药物和疫苗的设计提供理论依据。本研究对已被报道发现的两个在缓殖子期特异表达的基因三十四肽重复结构域蛋白DnaK-TPR及乳酸脱氢酶LDH2进行功能分析及调控机制研究,以解析弓形虫缓殖子分化发育的分子机制。对DnaK-TPR进行基因敲除并进行功能验证;确定LDH2启动子中的顺式调控元件及转录因子,探究其在缓殖子期表达的分子调控机制,并对新发现的转录因子进行基因敲除及功能验证。具体工作包括以下几个方面:(1)DnaK-TPR敲除株的构建及功能研究利用CRISPR/CAS9基因编辑技术对在缓殖子期高表达的一个三十四肽重复结构域蛋白DnaK-TPR进行基因敲除,成功获得敲除株后进行表型试验,通过空斑试验证明敲除株与野生株的生长没有明显差异;通过复制试验,证明敲除株的复制能力没有明显缺陷;通过缓殖子分化率试验证明DnaK-TPR敲除后并不影响缓殖子分化;通过小鼠毒力试验证明敲除DnaK-TPR后与野生株相比毒力有所下降;通过对感染敲除株及野生株存活小鼠的脑包囊进行统计分析发现DnaK-TPR敲除株与野生型相比小鼠的脑包囊形成没有明显差异。因此我们猜测,DnaK-TPR虽然在缓殖子期大量表达,但可能该基因只是缓殖子分化发育调控机制中的一个非意向性靶标,它只是响应缓殖子分化发育调控机制,但并不是直接参与缓殖子的分化发育过程中的靶基因。(2)LDH2基因在缓殖子期特异表达的调控机制研究构建LDH2启动子不同截短序列驱动EGFP表达的报告系统,通过检测报告基因表达效率确定了LDH2启动子中使其在缓殖子期表达的核心区域,并发现了其中一个GTGTGT重复结构域是LDH2启动子中的一个关键调控元件,并通过Co-IP试验在体外验证了LDH2启动子序列可以与AP2XI-4蛋白发生特异性结合,说明AP2XI-4可能是参与调控LDH2基因在缓殖子期表达的一个转录因子。为找到更多参与调控缓殖子分化发育的基因,我们通过蛋白组学分析了速殖子核蛋白与缓殖子核蛋白间的差异核蛋白,筛选到一个在缓殖子期表达上调的转录因子AP2Ⅻ-5。通过CRISPR/Cas9系统对AP2Ⅻ-5基因进行敲除,成功获得了AP2Ⅻ-5基因缺失株,并对缺失株进行表型分析,结果证明,敲除AP2Ⅻ-5后并不影响弓形虫的复制、缓殖子分化及脑包囊形成,但敲除株的毒力却显著下降,不能导致感染小鼠死亡。定量RT-PCR结果显示敲除AP2Ⅻ-5后BAG1、LDH2及ENO1的表达水平在缓殖子期下调,证明Tg AP2Ⅻ-5可能参与一些与缓殖子分化发育相关基因的调控。说明AP2Ⅻ-5是调控弓形虫毒力的一个转录因子,且参与LDH2等缓殖子相关基因的表达调控。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.72
【图文】：
华中农业大学 2018 届硕士研究生学位论文感染(Dubey 2008)。弓形虫在中间宿主体内完成无性生殖阶段，在形虫有速殖子和缓殖子两种形态。中间宿主经口吞食感染性卵囊子逸出并入侵肠壁细胞，以速殖子形式随血液或淋巴系统移行至全新的细胞，在宿主免疫能力缺陷时，速殖子可快速大量复制，从而伤和炎症反应，造成急性感染；但若在健康宿主体内，在宿主强有用下，速殖子可以转化为半休眠状态的缓殖子形式，其虫体繁殖能细胞中形成组织包囊逃避宿主的免疫作用，并可在机体内长期存活使宿主终生带虫。最终猫及猫科动物捕食及摄入含有组织包囊的中形虫的整个生活史（图 1-1）。人类在整个弓形虫生活史中并不是典却很容易通过食入未煮熟的含有组织包囊的肉制品或饮用被卵囊污,继而引发弓形虫眼病、脑病、流产等症状(Jones and Dubey 2l., 2015)。
图 1-2 体外弓形虫速殖子与缓殖子相互转化的影响因素（Lyons et al., 2002Fig.1-2 Factors associated with tachyzoite and bradyzoite interconversion in v（Lyons et al., 2002）形虫缓殖子分化发育的分子机制研究进展虫速殖子与缓殖子相互转化的机制是目前弓形虫领域研究的热点与、核酸微阵列等分子生物学技术的推广应用，及基因组学、转录组在弓形虫领域的运用为阐明这种转化机制提供了新的技术和方法，到解析，将对弓形虫病的检测、新型疫苗的设计和药物的研发提供新他顶复门原虫具有重大的理论指导意义。殖子与缓殖子期差异表达蛋白研究进展虫速殖子转化为缓殖子的过程中，伴随着形态结构改变和分子生物学一些阶段特异性抗原和新陈代谢发生变化(Denton et al., 1996, Fergu
殖子体内并不存在得以证明(Coppin et al., 2003)。基因表达分析也表明糖酵解在速殖子和缓殖子期被差异化调节，且参与糖酵解的多个酶均有两个亚型且在两个时期的表达有显著差异，如图1-3所示（数据来源于ToxoDB数据库），其中以烯醇酶和乳酸脱氢酶最为突出，ENO1和LDH2在缓殖子期特异表达，ENO2和LDH1在速殖子期大量表达(Dzierszinski et al., 1999, Yang and Parmley 1997)，从酶动力进行分析，发现LDH在缓殖子期的酶活性明显高于速殖子期，ENO1和ENO2的Km值相似，但ENO2的Vmax值确是ENO1的三倍，说明在这两个时期虫体的碳水化合物代谢机制存在差别
本文编号：2805266
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.72
【图文】：
华中农业大学 2018 届硕士研究生学位论文感染(Dubey 2008)。弓形虫在中间宿主体内完成无性生殖阶段，在形虫有速殖子和缓殖子两种形态。中间宿主经口吞食感染性卵囊子逸出并入侵肠壁细胞，以速殖子形式随血液或淋巴系统移行至全新的细胞，在宿主免疫能力缺陷时，速殖子可快速大量复制，从而伤和炎症反应，造成急性感染；但若在健康宿主体内，在宿主强有用下，速殖子可以转化为半休眠状态的缓殖子形式，其虫体繁殖能细胞中形成组织包囊逃避宿主的免疫作用，并可在机体内长期存活使宿主终生带虫。最终猫及猫科动物捕食及摄入含有组织包囊的中形虫的整个生活史（图 1-1）。人类在整个弓形虫生活史中并不是典却很容易通过食入未煮熟的含有组织包囊的肉制品或饮用被卵囊污,继而引发弓形虫眼病、脑病、流产等症状(Jones and Dubey 2l., 2015)。
图 1-2 体外弓形虫速殖子与缓殖子相互转化的影响因素（Lyons et al., 2002Fig.1-2 Factors associated with tachyzoite and bradyzoite interconversion in v（Lyons et al., 2002）形虫缓殖子分化发育的分子机制研究进展虫速殖子与缓殖子相互转化的机制是目前弓形虫领域研究的热点与、核酸微阵列等分子生物学技术的推广应用，及基因组学、转录组在弓形虫领域的运用为阐明这种转化机制提供了新的技术和方法，到解析，将对弓形虫病的检测、新型疫苗的设计和药物的研发提供新他顶复门原虫具有重大的理论指导意义。殖子与缓殖子期差异表达蛋白研究进展虫速殖子转化为缓殖子的过程中，伴随着形态结构改变和分子生物学一些阶段特异性抗原和新陈代谢发生变化(Denton et al., 1996, Fergu
殖子体内并不存在得以证明(Coppin et al., 2003)。基因表达分析也表明糖酵解在速殖子和缓殖子期被差异化调节，且参与糖酵解的多个酶均有两个亚型且在两个时期的表达有显著差异，如图1-3所示（数据来源于ToxoDB数据库），其中以烯醇酶和乳酸脱氢酶最为突出，ENO1和LDH2在缓殖子期特异表达，ENO2和LDH1在速殖子期大量表达(Dzierszinski et al., 1999, Yang and Parmley 1997)，从酶动力进行分析，发现LDH在缓殖子期的酶活性明显高于速殖子期，ENO1和ENO2的Km值相似，但ENO2的Vmax值确是ENO1的三倍，说明在这两个时期虫体的碳水化合物代谢机制存在差别
【参考文献】
相关期刊论文 前2条
1 张加勤;侯香华;宋秀宇;;弓形虫乳酸脱氢酶LDH2基因启动子的克隆及鉴定[J];中国人兽共患病学报;2013年04期
2 吴q ;王琼;郝丽;程璐;陈晓光;;弓形虫RH株体外培养及速殖子与缓殖子相互转化体系的建立[J];中国人兽共患病学报;2008年07期
本文编号：2805266
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