针刺足三里和曲池穴对大鼠溃疡性结肠炎的治疗作用研究

发布时间：2020-08-26 20:20

【摘要】：目的本课题组前期研究表明针刺穴位对2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-Trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)诱导的SD大鼠溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)模型有明确的疗效。在此基础上,本试验重点研究针刺穴位对大鼠UC模型结肠粘膜超微结构、炎症信号通路、氧化应激因子以及内质网应激相关蛋白表达的影响,为揭示针刺治疗UC的效应机理提供新的实验依据。方法以TNBS/乙醇灌肠诱导形成SD大鼠UC模型,4天后于“足三里”穴和“曲池”穴给予手针和电针处理,连续两周(20 min/次,隔日一次),以美沙拉嗪(500 mg/kg)灌胃作为药物对照组。试验期间观察并记录大鼠临床症状,两周后麻醉处死大鼠,取结肠组织观察外观及病理变化;用扫描电镜和透射电镜观察结肠黏膜超微结构的变化;酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测组织内炎性细胞因子、氧化应激相关因子以及镇痛相关因子含量;蛋白质印迹法(Western Blot,WB)检测核转录因子κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)通路和内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)关键蛋白的表达水平。结果1.针刺可明显减轻TNBS诱导的UC病变程度(1)与空白组比较,UC模型大鼠腹泻严重,肛周粘有多量粪便,体重增长缓慢,试验结束时粪便仍稀软。手针或电针治疗后,大鼠临床症状明显好转,其中电针组体重回升情况好于手针组和美沙拉嗪组。(2)剖检发现UC模型组大鼠结肠粗大,盲肠部位肿胀严重,有少量出血,结肠组织形态学评分显著高于空白组(P0.01),电针组结肠组织病变评分最低,其次为手针组和美沙拉嗪组。(3)HE染色镜检发现,与空白组比较,模型组结肠黏膜细胞排列不整齐,大量炎性细胞浸润,并有充血水肿。治疗组结肠黏膜基本完整,有少量炎性细胞浸润和少量充血。2.针刺可减轻TNBS所致结肠组织超微结构的损伤(1)扫描电镜观察结果:相比于空白组,模型组大鼠结肠黏膜损伤严重,绒毛破损,微绒毛严重缺损甚至消失,破损处可见有大量细菌附着。手针组肠黏膜病变显著减轻,但黏膜表面仍有不同程度的损伤,有些微绒毛处于倒伏状态。美沙拉嗪组类似于手针组,而电针组肠黏膜状态接近空白组。(2)透射电镜观察结果:与空白组相比,模型组结肠组织微绒毛稀疏变短,细胞核染色质分布不均,线粒体肿胀、线粒体嵴断裂或消失,内质网扩张。电针或手针治疗后,微绒毛排列较整齐,线粒体和内质网轻度肿胀,较接近于空白组。美沙拉嗪组也有类似变化。3.针刺对大鼠UC模型氧化应激水平、炎性细胞因子和镇痛因子的影响(1)在抗氧化水平方面,电针处理能显著升高UC大鼠结肠组织内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的表达水平,降低丙二醛(MDA)的含量(P0.01,P0.05),且效果优于手针组和美沙拉嗪组。(2)与模型组相比,电针处理能显著下调UC大鼠结肠组织中肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素(IL)-1β、髓过氧化物酶(MPO)和同型半胱氨酸(Hcy)的水平(P0.01,P0.05),同时提高IL-10的表达量。手针和美沙拉嗪组也有类似趋势。(3)相比空白组,模型组大鼠结肠组织内β-内啡肽(β-EP)水平显著降低(P0.01),5-羟色胺(5-HT)含量则明显升高(P0.01,P0.05);而针刺处理均能逆转上述因子变化。4.针刺对大鼠UC模型NF-κB信号通路和内质网应激的影响(1)与空白组比较,UC模型组大鼠B淋巴细胞瘤-2基因/B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白基因(Bcl-2/Bax)比值显著下降(P0.01),活化-半胱天冬酶3(cleaved-caspase3)表达水平明显升高(P0.01),针刺处理能逆转这种变化,且电针组更接近于空白组。(2)UC模型组大鼠结肠组织内磷酸化(p)-核因子κB抑制蛋白(IκBα)、p-p65表达水平显著升高(P0.01),电针或手针处理能明显抑制它们的表达(P0.01,P0.05)。(3)与空白组相比,UC模型组结肠内葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、磷酸化蛋白质激酶样内质网激酶(p-PERK)、磷酸化真核起始因子2α(p-eIF2α)表达量明显升高(P0.01,P0.05),电针处理能显著抑制这几种蛋白的表达水平(P0.01)。手针组和美沙拉嗪组也有类似趋势;而磷酸化需肌醇蛋白1(p-IRE1)、X盒结合蛋白-1s(XBP-1s)、活化转录因子6(ATF6)等蛋白表达水平在各组之间差异不显著(P0.05)。结论1.针刺“足三里”和“曲池”穴能明显减轻TNBS诱导的大鼠溃疡性结肠炎症状而具有明显的治疗作用,其中以电针效果最佳,且优于美沙拉嗪处理组。2.针刺穴位通过下调NF-κB信号通路中关键蛋白磷酸化水平,减少促炎细胞因子的产生,而增加抑炎细胞因子的生成,并能调节氧化应激水平和痛觉因子的水平,从而达到减轻UC的作用。3.TNBS可激活结肠细胞ERS中的未折叠蛋白反应(UPR)信号途径,穴位针刺可能通过调控UPR-PERK-eIF2α信号通路,降低过度的ERS,达到保护结肠黏膜的作用。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S853.61
【图文】：

示意图,实验流程,示意图,大鼠

１．４．１试验分组及处理方案逡逑将３５只ＳＤ大鼠随机分为５组（空白组、模型组、手针组、电针组、美沙拉嗪组）（见逡逑图１）。安静环境下饲养，室温控制在（２２邋±３）邋°Ｃ范围内，相对湿度约为（５０邋±３）邋％，逡逑笼内以消毒木屑为垫料，自然光照，自由饮食，预饲养４天以适应环境，然后开始试验。逡逑所有关于实验动物的操作符合扬州大学实验动物伦理会规定。逡逑ＳＤ大鼠逡逑逦１逦逡逑ｔ逦Ｉ逡逑｜空白组｜邋｜模型组｜邋｜手针组｜邋｜电针组｜邋｜美沙拉嗪组｜逡逑１逦逦逦！逡逑Ｉ逡逑｜ｔ；ｃ棋？邋？备逡逑生理盐水灌＠逦５％ＴＮＢＳ逡逑（１００ｍｇ／Ｋｇ，邋５０％邋乙酵）逡逑ｔ逦逦Ｉ逡逑逦邋逦邋１邋逦逡逑仅麻醉，不治衿逦曲＊￣ｎ逡逑逦１逦（w密把－ｌｍＡ，卜ｗｍｇ？．ｊ逡逑隔天一次７共７次逡逑＇逦．逦ｆ逡逑麻醉处死并采集五清＇邋结炀组纽样品逡逑图１实验流程示意图逡逑Ｆｉｇ．邋１邋Ｔｈｅ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｏｆ邋Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ邋ｄｉａｇｒａｍ逡逑１．４．２邋ＵＣ模型制备逡逑大鼠造模前禁食２４邋ｈ。用３％戊巴比妥钠（３７．５邋ｍｇ／ｋｇ）的生理盐水溶液进行腹腔注射逡逑麻醉，然后选取直径２．０邋ｎｉｍ，长约１０邋ｃｍ的娃胶管由肛门轻缓插入约８邋ｃｍ，结肠内丨次逡逑性灌注５％邋ＴＮＢＳ邋（１００邋ｍｇ／ｋｇ）与无水乙醇等量混合液。为确保注入的ＴＮＢＳ能够在大肠逡逑内弥散分布，注入后将大鼠尾巴提起，持续倒置３０邋ｓ；根据大鼠出现体质量明显Ｆ降，腹逡逑部胀大

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试验结束时粪便仍稀软。手针组开始时体重也不断下降，但造模后第７天即回升逡逑至造模前水平，肛周污染状况有所改善，基本无粪便粘连。电针组肛周干净，精神良好，逡逑较接近空白组，试验结束时体重回升最多（除空白组）（图２）。逡逑剖检后发现，空白组大鼠结肠细长，呈粉红色（见图３１１１邋）。模型组大鼠结肠粗大，逡逑盲肠肿胀严重，结肠部位少量出血。手针组大鼠结肠仍有肿胀，在直径和长度上与模型组逡逑相似，稍有改善。电针组大鼠结肠有较明显改善，在直径上较接近于空白组。从各组结肠逡逑病变计分（图３ＩＶ邋）来看，模型组病变严重，与空白组差异极显著（尸＜０．０１）邋？针刺治逡逑疗组与模型组比较，病变有明显的改善，差异显著（Ｐ＜０．０５），其中电针组较好。逡逑Ｉ逦＋邋空白组逦Ｈ邋ｒ—逡逑３５０．ｉ邋模型组逦、逡逑＋手针组逡逑ｌ邋２５０逦＾邋＾逡逑；二邋Ｉ逡逑２１°！逡逑0－Ｕ邋ｉ邋２邋ｉ邋４邋５邋６邋ｆ邋８邋ＳＩＯＩＩＩＳｌ＇ｓＭＩＳｉｅｉＶ逦画Qi逡逑Ｄａｙｓ逡逑图２各组大鼠体重变化（ｉ）和肛周污染状况（ｎ）逡逑Ｆｉｇ．２邋．邋Ｔｈｅ邋ｃｈａｎｇｅ邋ｏｆ邋ｂｏｄｙ邋ｗｅｉｇｈｔ邋ｏｆ邋ｒａｔ邋（邋Ｉ邋）邋ａｎｄ邋ｐｅｒｉａｎａｌ邋ｃｏｎ

结肠,大鼠,形态学,肛周

至造模前水平，肛周污染状况有所改善，基本无粪便粘连。电针组肛周干净，精神良好，逡逑较接近空白组，试验结束时体重回升最多（除空白组）（图２）。逡逑剖检后发现，空白组大鼠结肠细长，呈粉红色（见图３１１１邋）。模型组大鼠结肠粗大，逡逑盲肠肿胀严重，结肠部位少量出血。手针组大鼠结肠仍有肿胀，在直径和长度上与模型组逡逑相似，稍有改善。电针组大鼠结肠有较明显改善，在直径上较接近于空白组。从各组结肠逡逑病变计分（图３ＩＶ邋）来看，模型组病变严重，与空白组差异极显著（尸＜０．０１）邋？针刺治逡逑疗组与模型组比较，病变有明显的改善，差异显著（Ｐ＜０．０５），其中电针组较好。逡逑Ｉ逦＋邋空白组逦Ｈ邋ｒ—逡逑３５０．ｉ邋模型组逦、逡逑＋手针组逡逑ｌ邋２５０逦＾邋＾逡逑；二邋Ｉ逡逑２１°！逡逑0－Ｕ邋ｉ邋２邋ｉ邋４邋５邋６邋ｆ邋８邋ＳＩＯＩＩＩＳｌ＇ｓＭＩＳｉｅｉＶ逦画Qi逡逑Ｄａｙｓ逡逑图２各组大鼠体重变化（ｉ）和肛周污染状况（ｎ）逡逑Ｆｉｇ．２邋．邋Ｔｈｅ邋ｃｈａｎｇｅ邋ｏｆ邋ｂｏｄｙ邋ｗｅｉｇｈｔ邋ｏｆ邋ｒａｔ邋（邋Ｉ邋）邋ａｎｄ邋ｐｅｒｉａｎａｌ邋ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ邋（邋ＩＩ邋）逡逑Ｉ逡逑

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