鸭坦布苏病毒病-禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗的研制

发布时间：2020-08-27 07:12

【摘要】：2010年4月我国南方部分地区暴发了一种以蛋鸭产蛋下降为主要特征的新发传染病,研究表明该病病原隶属于黄病毒科(Flaviviridae),黄病毒属(Flavivirus),即坦布苏病毒。该病自暴发以来迅速蔓延至全国大部分养殖地区,对我国水禽养殖业造成了巨大的经济损失。在临床上,该病常与H9亚型禽流感呈混发或继发感染,因此研制用于防控此两种疫病的疫苗尤为迫切。本研究为了获得更高滴度的抗原,首先对坦布苏病毒的增殖条件进行了优化,结果表明病毒增殖的最适细胞株为BHK-21-JS株,最佳接毒剂量为0.001 MOI、最佳收获时间为感染后60 h,为坦布苏疫苗抗原的大规模制备提供了技术保障。本研究为建立合理的人工感染模型,将相同含量的抗原分别以脑内注射、肌肉注射、皮下注射、静脉注射和口服五种途径感染35日龄樱桃谷肉鸭,每组10只。在攻毒后每天观察临床症状并于第3 d、6 d、10 d测量各组体重进行分析。攻毒后1 d、2 d、3 d、4d、5 d采集血样,用蚀斑计数试验检测血液中病毒载量的变化情况。同时于攻毒后第3 d随机扑杀各攻毒组与对照组部分试验鸭,取脾脏样品进行组织病理学分析。结果显示各攻毒组均出现明显的感染坦布苏病毒后的临床症状,且以脑内注射组最为严重。各攻毒组体重总体均呈现出明显的下降趋势。血清样本噬斑计数试验结果表明五种攻毒途径均可导致鸭产生明显的病毒血症,其中以肌肉注射组血液中病毒含量最高。病理学分析结果显示各攻毒组均出现不同程度脾脏组织结构破坏及淋巴细胞坏死等现象,对照组未见明显病理变化。并将肌肉注射确定为后续灭活疫苗免疫效果判定的最佳攻毒途径。为研究不同佐剂对二联灭活疫苗免疫效果的影响,本研究利用卡波姆、白油、铝胶及蜂胶作为佐剂与相同含量的灭活抗原制备成不同佐剂的二联灭活疫苗,免疫24日龄樱桃谷肉鸭,免疫后应用血凝抑制试验和阻断ELISA方法分别测定鸭血清中禽流感病毒和坦布苏病毒的抗体水平,以对比不同佐剂疫苗的免疫效力。同时从抗体水平较高的组别于一免和二次免疫后选取5只进行攻击试验,采集攻毒后第1天和第2天血液样本进行病毒含量检测,评价疫苗的免疫保护效果。结果表明白油佐剂制备的疫苗组免疫效力最好。确定了制备二联灭活疫苗的最佳佐剂为白油佐剂。为研究不同坦布苏病毒抗原含量对灭活疫苗免疫效果的影响,本研究以0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL及1 mL四个不同坦布苏病毒含量制备的二联灭活疫苗免疫20日龄樱桃谷肉鸭,每组10只,免疫后每周采集血液样本检测抗体水平,试验结果表明当灭活疫苗免疫剂量为0.5 mL时即可以得到理想的免疫后抗体水平。为了完善免疫程序,另将30只20日龄非免疫樱桃谷肉鸭随机分为对照组、单次免疫组与两次免疫组3组,两次疫组于一免3周后进行加强免疫。免疫后定期采集血样分别用血凝抑制试验与阻断ELISA方法检测抗体。试验结果表明二次免疫后禽流感抗体及坦布苏病毒抗体阳性率均可达100%,免疫持续期可达18周以上。由此确定灭活疫苗最小免疫剂量为0.5 mL,灭活疫苗采取二次免疫能实现更为持久的免疫保护。
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.32
【图文】：

生长曲线,病毒,生长曲线,不同接种剂量

殖条件的优化计数方法测定BHK-21-JS细胞在不同接种剂量下种毒JS804所示，当 MOI 为 0.001 时，接毒后 60 h 病毒滴度最高，达 5.8；当 MOI 为 0.01 时，接毒后 60 h 病毒滴度为 5.4×104PFU/I 为 0.0001 时，病毒繁殖滴度上升较为缓慢，直到接毒后 7mL，随后呈明显下降趋势。最后确定得到最佳接种剂量为 0接种病毒后 60 h。T i m e p o s t - i n f e c t i o n ( h )Infe0 1 2 2 4 3 6 4 8 6 0 7 2012图 2.1 坦布苏病毒后在不同细胞上的生长曲线Fig.2.1 Growth curves of the TMUV in different cells

病毒感染,病毒,细胞,黄病毒属

1.3.4 坦布苏病毒的增殖病毒在 BHK-21 细胞上连续传代 17 次后采用蚀斑计数法测定各代次病毒滴度，结果显示，JS804 毒价稳定为 5×104PFU/mL。1.3.5 禽流感病毒的增殖按 Reed-Muench 法计算病毒液的病毒含量为 108.5ELD50/0.1 mL。1.4 讨论作为黄病毒属成员的坦布苏病毒可感染鹅、鸭等多种家禽，由于尚无有效治疗方法图 2.3 坦布苏病毒感染 BHK-21 细胞A：对照细胞；B：细胞感染病毒 48 hFig.2.3 BHK-21 infected by TMUVA: Non-infected BHK-21 cell culture control; B: Cytopathic effect observed 48h after inoculation oduck Tembusu virus.

体重变化,酒精,情况,二甲苯

in→90 %酒精 1 min→85 %酒精 1 min→自来水洗 2 min→苏木精染色来水洗 1 min→1 %盐酸酒精分化 20 s→自来水洗 1 min→稀氨水（1 %洗或蒸馏水洗 1 min→伊红染色 20 s 至 5 min→自来水洗 30 s→85 % %酒精 30 s→95 % I 酒精 1 min→95 % II 酒精 1 min→无水乙醇 I 2 miin→二甲苯 I 2 min→二甲苯 II 2 min→二甲苯 III 2 min→中性树胶封片果毒后各组体重变化情况毒组体重下降明显，其中肌肉注射组体重呈持续下降趋势；其他攻毒较肌肉注射组明显，但在攻毒后 6 天出现短暂回升，攻毒后 7 至 10总体呈下降趋势；空白对照组体重呈现明显上升趋势。由上可知，肌呈持续下降趋势，下降最为显著，见图 2.1。

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