小干扰RNA抑制猪流行性腹泻病毒在Vero细胞内的复制

发布时间：2020-09-03 11:01

　　 猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus PEDV)引起一类急性、高度接触性传染病。猪感染PEDV可引起肠道疾病,临床症状主要是仔猪的腹泻、呕吐和脱水。目前,该病在猪场频频暴发给养猪业造成了巨大的经济损失,因此研究预防和治疗PED的新制剂对于PED的防控具有重要的科学意义。RNA干扰(RNA interference,RNAi)现象是自然界中机体的一种防御机制,它也是一种强大的基因沉默技术。RNAi是指生物体外源或者内源dsRNA(double-stranded RNA)介导产生特异性的转录后基因沉默的现象,RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RTSC)降解靶mRNA。RNAi作为一种基因阻断技术,它凭借着灵敏特异性的优点广泛应用在基因功能研究及人类疾病治疗等领域。本研究拟通过RNA干扰技术来抑制猪流行性腹泻病毒在Vero细胞内的复制作用。PEDV M和N基因在不同毒株之间保守性都很高。其中M蛋白是病毒囊膜的主要组成成分,是跨膜糖蛋白,在病毒装配过程中起到重要作用,N蛋白与病毒基因组RNA构成螺旋核衣壳结构,在病毒进入细胞过程中起到很大的作用,同时也参与病毒颗粒组装和释放过程。M和N基因都是PEDV基因组中的重要基因,均参与病毒的复制。本研究以PEDV的M和N基因为靶基因,筛选出2个small interfering RNAs(siRNA)序列,然后设计1个与PEDV基因组没有同源性的siRNA序列作为阴性对照。继而合成编码三对shRNA型的核苷酸链。将单链核苷酸经过退火形成双链,分别将3对双链DNA连接克隆至pGenesil-1质粒载体的启动子下游,经过测序成功构建了针对PEDV特异的pGenesil-M和pGenesil-N 2个siRNA表达质粒和1个阴性对照质粒pGenesil-NC。在脂质体介导下将构成的3种质粒分别转染到Vero细胞,经G418筛选及PCR鉴定后,最终建立3个阳性重组细胞系。不同细胞系接种PEDV 48h后,检测病毒的TCID_(50)观察病毒滴度的变化,应用TaqMan实时荧光定量PCR方法测定病毒的mRNA水平,Western-blotting检测蛋白合成表达情况。在转染特异性pGenesil-M和pGenesil-N质粒的Vero细胞中,检测其病毒滴度、mRNA和蛋白水平均低于转染pGenesil-NC的阴性对照和未转染质粒的阳性对照。PEDV特异性pGenesil-M和pGenesil-N表达质粒能够不同程度地抑制病毒在Vero细胞中mRNA水平及M、N蛋白的合成,且pGenesil-N质粒的抑制作用显著高于pGenesil-M质粒。综上所述,本研究证明靶向PEDV的M和N基因的siRNA能够有效抑制PEDV在Vero细胞内的增殖。靶位不同的siRNA其抑制效果存在一定的差异。这些结果为研发防治PED的新制剂提供了科学依据。
【学位单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：

变不明显[27]。1.1.3 PEDV的病原学PEDV 在分类上属于尼多病毒目（Nidovirales）、冠状病毒科（Coronaviridae）、α-冠状病毒属（Coronavirus）。该病毒之所以称为冠状病毒是因为它多为球形，具有囊膜，呈皇冠状病毒粒子。PEDV 在 4 ℃或 37 ℃温度下 pH 6.5~7.5 能稳定存活，外界环境对该病毒影响较大，60 ℃温度下，半小时以上病毒就会失去感染活力，并对乙醚和氯仿等有机溶剂敏感[28]。1.1.4 PEDV的基因组结构及编码蛋白PEDV 单股正链 RNA 病毒，基因组全长约 28 kb[29]。PEDV 基因组结构如图 1-1 所示[30]，包含 7 个开放阅读框（open reading frames，ORFs）。ORF1a 和 ORF1b 较大位于 5′UTR 下游 2/3 基因组，剩下的 1/3 基因组编码 4 个结构蛋白分别是 S 蛋白、E 蛋白、M 蛋白、N 蛋白其中还包含一个 ORF3 非结构蛋白[31]。研究表明，在冠状病毒家族中的 5′UTR 还包含一个短 ORF，这个短的 ORF 编码 3-11 个氨基酸不等，且不同冠状病毒之间该序列与氨基酸序列存在差异，其作用是增强或抑制后面 ORF 的翻译[32]。

码子为 TTTTTT，选择 BamH I、Hind III 酶切位点，是便于与 pGenesil-1 酸链的合成均由上海生工生物工程有限公司完成。如表 2-2。表 2-2 shRNA 序列Table 2-2 shRNA sequence序列5'-GATCCCCAACTGGTGTAACGCTAATTCAAGAGATTAGCGTTACACCAGTTGGT5'-AGCTTTTCCAAAAAACCAACTGGTGTAACGCTAATCTCTTGAATTAGCGTTACA5'-GATCCGCACCAAATGTTGCAGCATTTCAAGAGAATGCTGCAACATTTGGTGCT5'-AGCTTTTCCAAAAAAGCACCAAATGTTGCAGCATTCTCTTGAAATGCTGCAAC5'-GATCCGCATTCGTATCGGTTCCATTTCAAGAGAATGGAACCGATACGAATGCT5'-AGCTTTTCCAAAAAAGCATTCGTATCGGTTCCATTCTCTTGAAATGGAACCGAT质粒pGenesil-shRNA的构建enesil-shRNA 质粒如图 2-1，参照 pGenesil-1 质粒图谱，调控 shRNA 的启RNA 插入位点是 BamH I、Hind III。构建质粒在真核细胞内大量表达 shRNer 酶等进一步加工成 siRNA。

PEDVRT-PCR检测100

【参考文献】

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本文编号：2811338