SARA奶牛瘤胃上皮细胞自噬变化以及对转运蛋白MCT1和SLC5A8表达的影响

发布时间：2020-09-04 15:35

　　伴随着我国奶牛养殖产业近几年来的飞速发展,目前初步达成了集约化的畜牧产业模式,但制约畜牧业发展的动物疾病也随之而来。亚急性瘤胃酸中毒(subacute rumen acidosis,SARA)是奶牛生产实践中常见的群发性营养代谢病,瘤胃液pH每天介于5.0~5.5之间的时间持续3小时以上则可定义为SARA。SARA发生原因是由于奶牛瘤胃内容物发酵产生的乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸(short-chain fatty acid,SCFA)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的含量增加,且在瘤胃内的吸收发生障碍,在瘤胃内大量积累。在瘤胃上皮细胞中钠离子耦合单羧酸转运蛋白1(SLC5A8)和氢离子耦合单羧酸转运蛋白1(MCT1)对SCFA的转运起重要作用,发生SARA的时候,瘤胃长时间处于低pH环境下,使其中的革兰氏阴性菌裂解死亡,释放出大量LPS。之前有研究表明高浓度的LPS可以损伤瘤胃上皮组织,并且在很多组织内可以引起自噬的发生。自噬是一个高度动态的生理过程,主要作用是分解细胞中衰老及破损的蛋白质大分子及细胞器,并产生氨基酸、脂肪酸等基础营养物质供给细胞,在生命活动中起到重要的作用。而高浓度的LPS使自噬被过度激活,结果大量的自噬体无法及时清除,导致异常积聚,但是LPS对瘤胃上皮细胞自噬的具体影响还没有确定。本试验采用体外实验和体内实验研究LPS对瘤胃上皮细胞自噬和转运蛋白SLC5A8和MCT1的影响。在体内实验中应用Western blot检测健康及SARA奶牛瘤胃上皮自噬关键蛋白雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路中关键蛋白磷酸化mTOR(pmTOR)、mTOR、微管相关蛋白1轻链3(LC3)和自噬降解底物(p62)蛋白表达的变化,以及MCT1、SLC5A8转运蛋白表达量的变化。结果显示mTOR和LC3蛋白表达量增多,pmTOR和p62蛋白表达量减少;通过透射电镜观察瘤胃上皮组织细胞内自噬泡形成,结果显示自噬泡增多。为进一步研究LPS对瘤胃上皮细胞自噬和转运蛋白SLC5A8和MCT1的影响,应用体外培养的瘤胃上皮细胞方式进行实验。将体外培养的细胞用LPS和组胺分别进行不同时间点的刺激,刺激时间点为0、1、3、6、9、18 h,结果表明LPS和组胺刺激瘤胃上皮细胞的最佳时间点为6h。进行不同LPS浓度梯度刺激(0,1,5,10μg/ml)和不同浓度组胺(0,20,40,60μM),Western blot检测LPS和组胺刺激的p-mTOR、mTOR、LC3、p62蛋白表达量的变化。结果显示LPS刺激的mTOR和LC3蛋白表达量上升,p-mTOR和p62蛋白表达量下降;组胺刺激的mTOR和LC3蛋白表达量下降,p-mTOR和p62蛋白表达量上升。为了验证高浓度LPS是否通过促进自噬来抑制转运蛋白MCT1、SLC5A8,将瘤胃上皮细胞分为空白对照组、LPS组、LPS+自噬的抑制剂(CQ、3-MA)组。Western blot检测LC3、p62蛋白表达变化和MCT1、SLC5A8转运蛋白表达变化,结果显示用高浓度LPS刺激转运蛋白MCT1、SLC5A8会被抑制,而当自噬被抑制的时候转运蛋白MCT1、SLC5A8会被激活。免疫荧光观察MCT1、LC3蛋白表达量的变化情况,结果显示当瘤胃上皮细胞处于高浓度LPS刺激会促进自噬的发生也会抑制转运蛋白MCT1的表达。综上所述,高浓度LPS会使瘤胃上皮细胞自噬加强,并且抑制转运蛋白MCT1、SLC5A8的表达,高浓度组胺则会抑制瘤胃上皮细胞自噬发生。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S823
【部分图文】：

过程图,自噬,溶酶体,自噬体

形成自噬体、自噬溶酶体的形成及自噬体降解[82]。自噬体的形成过程如图2-1[83]。自噬的激活受相对保守的自噬相关蛋白（Atg）的调控，自噬的启动首先需要Ⅲ型磷脂酰肌醇激酶 3（PI3K）和 Beclin1，单层膜的延伸需要受两个泛素化系统的调控，其中最主要的一个是将 LC3-Ⅰ转变为 LC3-Ⅱ，而 LC3-Ⅱ的积累和定位到自噬小体膜上是自噬体存在和形成的标志。自噬体的产生还受到自噬抑制剂雷帕霉素复合物 1（mTORC1）的调控，雷帕霉素是一种自噬的激动剂，它不但能抑制 mTORC1 的激活，还可以诱导自噬的发生[84]。自噬涉及到清除受损或过多的细胞器，当线粒体功能障碍或由于外界应激导致过氧化物酶体的改变

组蛋白,内参,牛瘤胃

是多余气泡排出，否则会影响后续测量。1.2.5 统计学分析运用 SPSS 19.0 统计学分析软件。采用 One-wayANOVA 对实验结果进行显著性分析，结果显示：当 P<0.05 时为差异显著；当 P<0.01 时为差异极显著，均具有统计学意义。1.3 结果与分析1.3.1 健康及 SARA 牛瘤胃上皮 MCT1、SLC5A8 转运蛋白表达量的变化通过 Western blot 实验观察 MCT1、SLC5A8 转运蛋白表达的变化，如图 1-1所示 SARA 状态下的奶牛的 MCT1、SLC5A8 转运蛋白表达下降，说明发生SARA 时会抑制 SCFA 转运蛋白的表达。

透射电镜,灰度分析,组蛋白,内参

图 1-2 A:mTOR 通路的四种蛋白 pmTOR、mTOR、p62、LC3 和内参β-Actin正常组和 SARA 组蛋白表达量对比。B:LC3 的灰度分析。C:p62 的灰度分析。D:mTOR 的灰度分析。E:pmTOR 的灰度分析。Figure 1-2 A: Comparison of protein expression levels of the four proteins pmTOR,mTOR, p62, LC3 and internal reference β-Actin in the mTOR pathway and SARA.B: Grayscale analysis of LC3. C: Grayscale analysis of p62. D: Grayscale analysis ofmTOR. E: pmTOR grayscale analysis。1.3.3 健康及 SARA 牛瘤胃上皮透射电镜结果透射电镜观察瘤胃上皮组织内自噬泡，如图 1-3 所示，正常牛自噬情况正常，发生 SARA 时自噬泡增多，自噬过度积累。

【相似文献】