microRNA-193b-3p靶向MAML1调节硒缺乏肉鸡肝细胞凋亡的研究

发布时间：2020-09-07 12:13

　　硒(Selenium,Se)是一种必需微量元素,在保持机体健康和维持体内平衡中发挥作用。硒缺乏时影响细胞增殖,氧化应激以及细胞存活,并可导致多种器官损伤,如脑、静脉、肌肉、肠和肝组织的损伤。许多研究表明日粮硒缺乏可诱导机体肝细胞凋亡。肝脏是人体吸收营养物质的主要器官,是硒缺乏反应的主要靶标之一。肝细胞凋亡是肝组织硒缺乏的特征性病理变化。microRNA(miRNA)作为一段非编码RNA,可以通过靶向性介导目的基因转录使目的基因沉默,进而调控蛋白表达来操控体内不同的生物反应,它在细胞增殖、分化、凋亡和肿瘤发生发展中起重要作用。研究表明多种miRNA通过影响细胞凋亡因子,参与到凋亡的发生和发展的调控中。miRNA在肝脏疾病中也发挥巨大作用。近年来,研究表明机体硒含量的降低可改变相关器官内miRNA的表达。然而,关于硒缺乏期间细胞凋亡的发生具体机制以及miRNA如何调控肉鸡肝细胞凋亡的研究尚未完善。本研究的目的是研究miRNA诱导缺硒肝细胞凋亡的发生机理。为阐明硒缺乏对肝细胞凋亡过程中特异性miRNA及其靶蛋白的作用机制,本研究复制了硒缺乏肉鸡模型,通过实验室组学研究以及实时定量PCR(qRT-PCR)方法筛选出特异性强的miRNA,miR-193b-3p。结合生物信息学预测,双荧光素酶报告基因检测系统和qRT-PCR方法分析并筛选出硒缺乏型肉鸡肝脏凋亡的特异性靶蛋白MAML1。本研究通过超微结构观察、qRT-PCR、蛋白印迹(WB)以及流式细胞术检测等方法检测硒缺乏型肉鸡肝脏和miR-193b-3p转染的原代肝细胞的凋亡。试验结果如下:(1)成功复制缺硒性肉鸡模型基础上,观察缺硒肉鸡肝细胞变化,超微结构观察显示肝细胞核浓缩,核仁变小,核质成块状凝聚于核膜周边,线粒体产生空泡,有些线粒体破裂,线粒体嵴消失等多种凋亡特征,说明缺硒引起肉鸡肝细胞凋亡。(2)筛选出miR-193b-3p是硒缺乏特异性miRNA,在缺硒肉鸡肝脏中呈显著高表达。在建立鸡原代培养肝脏细胞模型基础上,成功构建了miR-193b-3p过表达和敲低模型。预测并成功验证了miR-193b-3p与其靶基因MAML1的关系。miR-193b-3p与MAML1的表达呈负相关。(3)在建立鸡原代培养肝脏细胞miR-193b-3p过表达/抑制模型的基础上,用STAT1抑制剂Fludarabine(Flu)处理miR-193b-3p过表达的肝细胞。结果显示肝脏细胞过表达miR-193b-3p时,细胞早期凋亡,晚期凋亡比率与对照组相比明显上升。而敲低miR-193b-3p后,细胞凋亡率与对照组相比明显下降,加入Flu后,细胞凋亡率仍然比对照组低。(4)通过对缺硒诱导的凋亡分子机制的研究发现,miR-193b-3p过表达诱导的凋亡可能是通过线粒体途径产生。qRT-PCR和WB方法检测凋亡通路中关键基因的表达,结果显示,miR-193b-3p过表达增加了IFNγ、STAT1、IRF1、Bak、Bax、Cyt-c、Caspase9和Caspase3的释放,并抑制了MAML1和Bcl_2的释放。(5)硒缺乏肉鸡肝脏组织中miR-193b-3p表达上调而MAML1表达下调,为进一步验证肝细胞凋亡调控机制,本试验检测了硒缺乏肉鸡肝脏中凋亡相关基因的表达。结果与体外培养原代肝细胞转染miR-193b-3p一致,表明miR-193b-3p和其靶基因MAML1参与了低硒引起的肝脏线粒体通路的凋亡。总之,结果表明硒缺乏可以通过调控miR-193b-3p的表达,介导其靶蛋白MAML1参与线粒体途径的肉鸡肝细胞凋亡。这为硒缺乏导致的肝细胞损伤机制的研究提供了新的思路。
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S858.31
【部分图文】：

硒缺乏,肝细胞凋亡

和硒缺乏组的肉鸡没有出现死亡现象。对照组的肉鸡饮水和饲喂正长良好，排泄物正常。缺硒组肉鸡鸡出现一些异常现象，如运动，胸部和翼部区域出现青色或褐色斑点。尸检结果显示，硒缺乏组典型的缺硒性渗出性素质（ED）。在缺硒组实验的第 20 天，90 只因此，我们证实了由缺硒饮食引起的缺硒肉鸡模型成功复制。在硒缺乏组肝脏中的活性低于对照组（表 3-1）。为了研究硒缺乏对研究通过透射电子显微镜观察了硒缺乏肉鸡肝脏组织的超微结构变。对照组肉鸡肝细胞显示正常的结构；而在硒缺乏组观察到肝细胞征，细胞核浓缩、核仁变小、线粒体产生空泡，有些线粒体出现破种特征。这些结果均表明，硒缺乏可导致肝细胞凋亡。肉鸡硒缺乏表 3-1 对照组及硒缺乏组硒含量Tab. 3-1 Se status in C group and Se deficiency groupC group Se deficiency grouPx in liver（U/mg.pr） 941.68±24.69 427.44±32.46 *** liver（μg/mg） 5.769±0.026 1.487±0.017 ***

硒缺乏,肉鸡,肝组织

硒缺乏介导 miR-193b-3p 调控特异性靶标 MAML1 硒缺乏对肉鸡肝脏 miR-193b-3p 表达的影响据实验室高通量测序结果以及 qRT-PCR 方法对相关 miRNA 的检测显示，mp 是肝组织硒缺乏的特异性 miRNA 之一。正常肝组织和缺硒肝组织中 miR-193b含量如图 3-2 所示。结果显示，miR-193b-3p 在缺硒肝组织（L 组）的表达水平组织（C 组）显著上调，高于正常组 7 倍，差异具有统计学意义（P<0.05）。可，miR-193b-3p 的表达增加。结合电镜观察结果，miR-193b-3p 作为硒缺乏肝组 miRNA 可能与硒缺乏诱导的肝细胞凋亡有关。

浓度检测,转染,过表达,肝脏细胞

（I-100、I-150 和 I-200）降低，miR-193b-3p inhibitor 终浓度在 100 n于对照组，下降了 60%以上（P<0.05）。因此，本研究中使用的 miRN的，肝脏细胞 miR-193b-3p 的过表达/抑制体外模型建立成功，可用于，过表达组转染 miR-193b-3p mimic 的终浓度为 100 nM；抑制组转ibitor 的终浓度为 100 nM 时可达到最佳转染效果。

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