BAG2在巨噬细胞抗结核分支杆菌感染过程中介导免疫调控的机制研究

发布时间：2020-09-07 13:55

　　结核病是一种人畜共患的慢性传染病,对人类健康和畜牧业的发展均造成重大威胁。结核分支杆菌是结核病的致病菌,它能够成功地寄宿在宿主巨噬细胞中,一方面宿主启动免疫反应抑制病原体的增殖和扩散,另一方面结核分支杆菌进化各种策略逃避宿主免疫系统的清除。为了抵抗这一致病菌的感染,充分了解宿主与病原体相互作用过程的分子机制是至关重要的。感染过程中,细胞凋亡、自噬、炎性反应和内质网应激之间存在内在联系,且均可影响细胞命运和结核分支杆菌在宿主体内的存活。已有研究表明BCL相关抗死亡基因2(BAG2)与细胞在不同病理条件下的命运决定有关,然而,BAG2在结核分支杆菌感染过程中发挥的作用尚不清楚。本研究以小鼠原代巨噬细胞BMDMs、巨噬细胞系RAW264.7和J744A.1为靶细胞,主要探讨结核分支杆菌诱导的内质网应激条件下,BAG2在巨噬细胞中的作用以及其分子机制,主要研究内容和结果如下:1.研究在结核分支杆菌感染诱导的内质网应激中,BAG2表达变化及调控其变化的机制。首先,通过定量PCR和免疫印迹,研究结核分支杆菌感染巨噬细胞后对内质网应激影响以及BAG2表达的动态变化,结果证实结核分支杆菌感染巨噬细胞后,内质网应激标志蛋白HSPA5和CHOP表达增加,激活内质网应激。同时,本研究结果表明巨噬细胞无论在结核分支杆菌强毒株H37Rv还是弱毒株H37Ra刺激下,BAG2均以时间依赖方式表达下调。之后,通过双荧光素酶报告和染色质免疫共沉淀,研究在感染条件下Bag2启动子核心区域及未折叠蛋白反应中ERN1-XBP1信号通路对BAG2转录调节,结果发现,干扰Ern1或Xbp1抑制感染对BAG2表达影响,恢复BAG2的表达,XBP1结合在Bag2启动子上,抑制其转录。2.研究BAG2在结核分支杆菌感染过程中的功能。首先,通过流式细胞术和CFU计数,研究结核分支杆菌感染巨噬细胞后干扰或过表达BAG2对细胞和结核分支杆菌存活的影响。结果显示干扰Bag2增加细胞凋亡率,抑制细胞活性,从而减少细胞内结核分支杆菌的存活。然后,通过免疫印迹、免疫荧光和透射电子显微镜,研究结核分支杆菌感染巨噬细胞后沉默或过表达Bag2对细胞自噬影响以及其是否通过自噬影响细胞存活。结果证明BAG2增加自噬标记蛋白LC3-II表达和LC3自噬体形成,促进自噬流,并且激活内质网自噬,表现为自噬体与内质网定位增加。随后,利用自噬抑制剂抑制自噬早期或晚期,结果表明在感染条件下抑制自噬增加细胞凋亡。加入自噬抑制剂Baf A1阻碍BAG2对细胞保护作用,细胞活性降低。3.研究BAG2激活细胞自噬和内质网自噬的作用机制。通过免疫共沉淀和免疫印迹,研究干扰Bag2对BCL2和BECN1相互作用的影响。结果显示干扰Bag2抑制ERK1/2和BCL2磷酸化,抑制结核杆菌诱导的BCL2和BECN1解离。同样地,加入ERK抑制剂U0126阻断BAG2对自噬的影响,表明BAG2通过ERK信号通路磷酸化BCL2,促进BECN1解离,激活自噬。之后,通过免疫荧光和免疫共沉淀研究BAG2与自噬受体蛋白SQSTM1相互作用对内质网自噬的影响。研究结果证明BAG2与SQSTM1相互作用依赖PB1和UBA结构域。过表达BAG2显著增加SQSTM1在内质网的定位,促进内质网自噬。4.研究miR-27b/BAG2对炎性反应的影响。通过定量PCR和双荧光素酶报告,研究在结核分支杆菌感染过程中miR-27b动态变化及调控其变化的机制。研究证实巨噬细胞无论感染强毒株H37Rv还是弱毒株H37Ra,miR-27b表达均逐渐增加。感染后TLR2/MyD88/NF-κB信号通路被激活,促进miR-27b转录。其后,通过双荧光素酶报告和免疫印迹,结合生物信息学分析预测和验证Bag2是miR-27b功能性靶基因。结果证明miR-27b直接靶向Bag2 3'UTR,抑制内源性BAG2表达。本研究进一步探索miR-27b/BAG2对炎性因子的影响及作用机制。结果发现miR-27b抑制NF-κB p65激活从而抑制炎性因子的产生,而BAG2激活NF-κB活性。功能挽救实验证明BAG2减弱miR-27b对炎性因子的抑制作用,表明miR-27b/BAG2通过调控NF-κB活性影响炎性因子表达。基于以上研究结果,揭示了BAG2在结核分支杆菌感染巨噬细胞中的功能和作用机制,一方面BAG2在内质网应激条件下,通过细胞凋亡和自噬在调控细胞稳态和结核杆菌存活中发挥重要作用,另一方面BAG2参与miR-27b对炎性反应的调控,避免过度炎性反应,以平衡感染和组织损伤。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.618
【部分图文】：

示意图,自噬,示意图,隔离膜

西北农林科技大学博士学位论文PI3P，这可能为隔离膜形成提供了平台(Matsunaga et al. 2010; Hamasaki et al. 2013)。Beclin1 是自噬信号的整合因子。在 mTOR 被抑制时，ULK1 直接磷酸化 Beclin1，并激活 hVPS3(Russell et al. 2013)。在缺氧和感染过程中，BECN1 从 BCL2 的自噬抑制复合物中解离出来，BCL2 能刺激 hVPS34 活性(Levine and Deretic 2007)。

未折叠蛋白,分子机制,转录因子

西北农林科技大学博士学位论文白质的合成，它也磷酸化氧化还原代谢的转录因子 NRF2（nuclear factor erylated factor 2）(Cullinan et al. 2003)。磷酸化的 eIF2α 促进活化转录因子 4（actiscription factor 4，ATF4）mRNA 的翻译，ATF4 编码下游的转录因子，控制参凋亡、氨基酸代谢及抗氧化反应的基因的转录(Avivar-Valderas et al. 2011; B'C013a; Walter et al. 2015)。正常情况下，ATF6 以无活性的碱性亮氨酸拉链（ine zipper，bZIP）转录因子形式存在于细胞质。应激条件下，ATF6 与 coat pCOPII）复合物相互作用，转移至高尔基体，被 site 1 蛋白酶（S1P）和 S2P 胞浆结构域（ATF6f）(Haze et al. 1999)。ATF6f 促进编码 ERAD 组分的基因和 (Yamamoto et al. 2007)。

巨噬细胞,结核分支杆菌,免疫印迹,细胞印迹

图 2-1 结核杆菌感染诱导巨噬细胞发生内质网应激Figure 2-1 M. tuberculosis infection induces ER stress核分支杆菌强毒株（H37Rv）（A）和弱毒株（H37Ra）（B）分别按照图示时间点处理 RAW2 BMDM 细胞，免疫印迹检测 HSPA5 和 CHOP 蛋白表达。W264.7 cells and BMDMs were infected with M. tuberculosis H37Rv (A) and H37Ra (B) foicated times. Expression levels of HSPA5, CHOP and GAPDH were determined by western blot.2.2 感染条件下 BAG2 表达情况确定结核分支杆菌可以诱导内质网应激后，检测结核分支杆菌诱导的内质网应件下 BAG2 的表达变化。利用 H37Rv 和 H37Ra 感染 RAW264.7 和 BMDM 细胞印迹（图 2-2A）和定量 PCR（图 2-2B）检测 BAG2 表达。定量 PCR 和免疫印迹果均表明结核分支杆菌抑制 BAG2 的表达。此外，本研究还利用内质网应激诱导剂衣霉素（Tunicamycin，TM）和毒胡萝（Thapsigargin，TG）处理巨噬细胞。如图 2-3A，HSPA5 和 CHOP 表达增加，内

【相似文献】