猪丹毒丝菌灭活疫苗的制备及其对小鼠的免疫效力研究

发布时间：2020-09-15 11:15

　　猪丹毒(Swine erysipelas)是由猪丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)引起的一种急性、热性人畜共患传染病。近几年,该病的发病率和死亡率呈明显上升趋势,给养猪业造成了巨大经济损失。本实验室前期在江淮地区42株猪丹毒丝菌临床分离株(血清型均为1a型)中筛选出3株致病性强、抗原性好、遗传稳定的制苗用菌株。本研究通过对制苗用菌株生长培养基的筛选、甲醛灭活浓度和时间的摸索以及免疫佐剂的选择三个方面来提高猪丹毒丝菌灭活疫苗的免疫原性,并与商品化疫苗进行免疫效果比较,以期为该病的防控及联合疫苗的研究提供理论依据。将筛选出的3株制苗用菌株(AEr 21、AEr 31和AEr 32)作为受试菌株进行如下试验:(1)利用平板菌落计数、OD_(600)值测定以及全菌体蛋白浓度测定的方法,比较受试菌株在含0.6%酵母浸膏胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB-YE)、猪丹毒疫苗培养基及改良猪丹毒疫苗培养基中的生长状况。(2)将终浓度为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的甲醛溶液加入生长至稳定期的受试菌株中,分别灭活5、9、10、11、12、13、14、15、20 h后,用液体培养基和动物试验检验菌株的灭活情况。(3)受试菌株在终浓度为0.2%的甲醛灭活11h后,按不同比例分别与5种佐剂(弗氏佐剂、铝胶佐剂、蜂胶佐剂、矿物油佐剂ISA 201 VG、聚合物佐剂)制备成猪丹毒丝菌灭活疫苗,经物理性状检验、无菌检验和安全检验合格后免疫小鼠,应用ELISA方法检测小鼠血清中IgG抗体水平和细胞因子含量(IL-4、IL-10、MCP-1、TNF-β、IFN-γ),分别采用口服灌胃和腹腔注射方式进行攻毒保护性试验,测定免疫保护力。(4)3株受试菌株在改良猪丹毒疫苗培养基中生长至稳定期,经终浓度为0.2%的甲醛灭活11h后,用矿物油佐剂ISA 201 VG制备的灭活疫苗与商品化疫苗同步免疫小鼠。应用ELISA方法检测小鼠血清中IgG抗体水平和细胞因子含量(IL-4、IL-10、MCP-1、TNF-β、IFN-γ),流式细胞术测定CD4~+/CD3~+、CD8~+/CD3~+T细胞亚群,采用口服灌胃和腹腔注射方式测定攻毒保护率,并采集小鼠组织脏器(脾脏、肺脏、肝脏、肾脏)制备病理组织切片,观察病理变化。结果显示:(1)3株受试菌株(AEr 21、AEr31和AEr 32)在三种培养基中的菌落总数分别为3.8×10~8~6.1×10~8、3×10~9~3.8×10~9、4.75×10~9~5×10~9 CFU/mL、OD_(600)值分别为1.01~1.39、1.11~1.52、1.39~2.07、全菌体蛋白浓度分别为8.14~10.31、9.46~11.42、11.21~13.41 mg/mL。(2)终浓度为0.2%、0.3%、0.4%的甲醛灭活11h以上可将受试菌株全部灭活。(3)受试菌株与5种佐剂制备的灭活疫苗免疫小鼠后均可产生较好的细胞免疫和体液免疫,其中矿物油佐剂ISA 201 VG灭活疫苗组诱导产生的抗体和细胞因子水平最高,且与弗氏佐剂、铝胶佐剂灭活疫苗组差异显著(P0.05),与其他佐剂灭活疫苗组差异不显著(P0.05);攻毒后,矿物油佐剂ISA201 VG灭活疫苗组的免疫保护率最高,分别为80%~100%、60%~80%。(4)AEr 21、AEr31、AEr 32全菌体灭活疫苗组和商品化弱毒、灭活疫苗组二次免疫小鼠后的血清IgG抗体效价分别为1:3200、1:6400、1:1600、1:6400、1:3200(以全菌体的超声裂解物为包被抗原)和1:3200、1:6400、1:3200、1:25600、1:6400(以重组SpaA为包被抗原);商品化弱毒疫苗组诱导小鼠产生细胞因子含量和CD4~+/CD3~+、CD8~+/CD3~+T细胞比例最高,与灭活疫苗组差异显著(P0.05),各灭活疫苗组间差异均不显著(P0.05);AEr 21、AEr31、AEr 32全菌体灭活疫苗组和商品化弱毒、灭活疫苗组对口服灌胃和腹腔注射的攻毒保护率分别为80%、100%、100%、100%、100%和80%、100%、60%、100%、100%;AEr 21、AEr 32全菌体灭活疫苗组的病理组织变化较AEr31全菌体灭活疫苗组和商品化弱毒、灭活疫苗组更明显。结果表明:受试菌株(AEr31株)以改良猪丹毒疫苗培养基作为生长条件、经终浓度为0.2%的甲醛37℃振荡灭活(150 r/min)11 h后,与矿物油佐剂ISA 201 VG制备成灭活疫苗的免疫效果最好,免疫小鼠后不仅可产生较高水平的细胞免疫和体液免疫,还可完全抵抗强毒株的攻击。
【学位单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.4
【部分图文】：

生长曲线,培养基,猪丹毒,生长曲线

图 2-1 AEr 21 在三种培养基中的生长曲线Fig. 2-1 Growth curve of AEr 21 in three culture media② AEr31 在 TSB-YE 培养基中生长12 h~14 h达到稳定期，菌落总数最大值.1×108CFU/mL；在猪丹毒疫苗培养基中生长12 h达到稳定期，菌落总数最大值为109CFU/mL；在改良猪丹毒疫苗培养基中生长12 h达到稳定期，菌落总数最大值.8×109CFU/mL。结果显示，AEr 31在改良猪丹毒疫苗培养基中含菌量最多（见-2；图2-2）。表 2-2 菌落计数法测定 AEr 31 在三种培养基中的生长情况Table 2-2 Determination of AEr 31 strain growth in three media by colony count时间 (h)细菌数（CFU/mL）细菌的对数值 (lg)TSB-YE 培养基猪丹毒疫苗培养基改良猪丹毒疫苗培养基TSB-YE 培养基猪丹毒疫苗培养基改良猪丹毒疫培养基0 1.5×1061.5×1061.5×1066.176 6.176 6.176

生长曲线,培养基,猪丹毒,生长曲线

图 2-2 AEr 31 在三种培养基中的生长曲线Fig. 2-2 Growth curve of AEr 31 in three culture media③ AEr32 在 TSB-YE 培养基中生长10 h~12 h达到稳定期，菌落总数最大值.8×108CFU/mL；在猪丹毒疫苗培养基中生长12 h达到稳定期，菌落总数最大值.5×109CFU/mL；在改良猪丹毒疫苗培养基中生长12 h达到稳定期，菌落总数最为5×109CFU/mL。结果显示，AEr 32 在改良猪丹毒疫苗培养基中含菌量最多（2-3；图2-3）。表 2-3 菌落计数法测定 AEr 32 在三种培养基中的生长情况Table 2-3 Determination of AEr 32 strain growth in three media by colony count间 (h)细菌数（CFU/mL）细菌的对数值 (lg)TSB-YE 培养基猪丹毒疫苗培养基改良猪丹毒疫苗培养基TSB-YE 培养基猪丹毒疫苗培养基改良猪丹毒疫苗养基01.5×1061.5×1061.5×1066.176 6.176 6.176

生长曲线,培养基,生长曲线,猪丹毒

图 2-3 AEr 32 在三种培养基中的生长曲线Fig. 2-3 Growth curve of AEr 32 in three culture media.2 OD600值测定结果受试菌株（AEr 21、AEr 31、AEr 32）分别在三种培养基中，经37℃振荡培养（in）16 h，其间每隔2 h，即采用测定OD600值的方法检测菌液浓度。① 相同的时间点，AEr 21在改良猪丹毒疫苗培养基中的OD600值最高，这一平板菌落计数的结果相一致，显示改良猪丹毒疫苗培养基对AEr 21的生长效见表2-4）。表 2-4 OD600值测定 AEr 21 在三种培养基中的生长情况Table 2-4 Determination of AEr 21 growing sate in three media by the OD600时间(h)OD600值TSB-YE 培养基猪丹毒疫苗培养基改良猪丹毒疫苗培养基0 0 0 0

【参考文献】