猪IL-12与TGEV S1核酸疫苗联合免疫保护效果研究
发布时间：2020-09-19 22:41
猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)能够引发猪急性高度接触性的消化道传染病,即猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)。感染动物以呕吐、严重的腹泻、脱水为主要症状,而且经常同其他疾病混合发生,所有品种和年龄的猪对此病毒都易感,新生仔猪尤为严重,随着日龄的增大死亡率逐渐下降。猪传染性胃肠炎病毒包膜突起形状的S蛋白在病毒表面,介导粘合到宿主受体和膜融合,其可以分为S1和S2区域,S蛋白是病毒中和抗体产生的一个主要的靶点。自上世纪90年代以来,TGEV导致了全球性的严重的经济损失,一些疫苗制备技术被发展和商业化,目前国内主要为猪传染性胃肠炎病毒-猪轮状病毒-猪流行性腹泻病毒三价弱毒疫苗,但存在免疫效果不确实和返祖等缺陷,故TGEV新型高效疫苗研究尤为迫切,其中以新型基因工程疫苗的研究和开发为热点。猪白细胞介素12(Porcine interleukin 12,pIL-12)是一种重要的多功能免疫调节细胞因子,IL-12能诱导干扰素γ(Interferonγ,IFN-γ)产生并且引发CD4~+T细胞分化为Th1(T辅助细胞)型细胞,IL-12有多种重要的生物学功能,它关系到早期非特异性的先天免疫和之后的特异性抗原获得性免疫,可作为免疫佐剂提高疫苗的免疫保护效果。本研究对辽宁省抚顺市60个规模猪场进行了TGEV感染分布情况的调查,对有腹泻症状的仔猪共采集了300份样品,通过RT-PCR方法对TGEV的感染情况进行了调查,并对TGEV关键基因S基因进行了生物信息学分析。通过分子生物学技术利用pVAX1载体,分别构建了TGEV Purdue 46毒株S1基因和猪IL-12基因的真核表达质粒pVAX1-TGEV-S1和pVAX1-pIL-12-(p40)-(p35)。利用脂质体转染技术将两种质粒转入BHK细胞中,通过免疫荧光试验检测其蛋白表达。选取20头7日龄无TGEV病原感染和抗体的仔猪随机分成5组,分别是pIL-12+TGEV-S1组、TGEV-S1组、pIL-12组、pVAX1组、空白组,从7日龄开始,用重组真核表达质粒pVAX1-TGEV-S1和pVAX1-pIL-12-(p40)-(p35)免疫,每次免疫间隔14天,共免疫3次,每间隔7天采集血液样品,并于第三次免疫后7天进行攻毒,攻毒后5天捕杀猪只并采集血液及组织学样品。采集样品通过淋巴细胞增殖试验、流式细胞检测技术、酶联免疫吸附试验、病毒中和试验、组织冰冻切片荧光检测和HE染色等方法,分别对不同组别及不同日龄仔猪样品进行了细胞免疫和体液免疫及免疫保护相关指标的检测。试验结果表明,辽宁省抚顺市60个规模猪场的300份样品,共检测出阳性样品3份,通过对S基因的克隆测序、结构分析、序列同源性分析、系统进化树分析和蛋白结构分析,与其他17个参考毒株的S基因相比较,有5处核苷酸的变异,造成了4处氨基酸的变化,有1处氨基酸的变化导致了蛋白质二级结构的改变,与WH1、Almazan毒株S基因的同源性和亲源性最高,属于Purdue毒株分支,与目前普遍流行的毒株相近。试验构建了TGEV Purdue 46毒株S1基因和猪IL-12基因的真核表达质粒pVAX1-TGEV-S1和pVAX1-pIL-12-(p40)-(p35),将两种质粒转染BHK细胞后,所表达的蛋白通过免疫荧光试验都能够被其特异性多克隆抗体检测到明显的荧光信号。动物免疫保护试验,TGEV-S1组和pIL-12+TGEV-S1两种重组表达质粒的免疫组,在不同的免疫指标检测中,有不同程度的升高,相比较于空白组和pVAX1组有明显的差异,其中pIL-12+TGEV-S1组的结果尤为显著。在淋巴细胞增殖试验、TGEV S1特异性IgG抗体检测、TGEV中和抗体检测中,TGEV-S1组和pIL-12+TGEV-S1组有明显升高,其中pIL-12+TGEV-S1组尤为明显,与TGEV-S1组相比较差异显著(p0.05),与空白组、pVAX1组、pIL-12组相比较差异极显著(p0.01)。在CD4~+T淋巴细胞检测、CD8~+T淋巴细胞检测、IFN-γ细胞因子检测、细胞毒性T淋巴细胞检测中,pIL-12组、TGEV-S1组和pIL-12+TGEV-S1组都有明显升高,其中pIL-12+TGEV-S1组尤为明显,与空白组、pVAX1组相比较差异极显著(p0.01)。肠道组织病毒分布的免疫荧光检测和病理组织学检查表明,TGEV-S1组和对照组之间差异明显,其中pIL-12+TGEV-S1联合免疫组病毒含量更少,组织损伤更轻。说明pIL-12作为免疫佐剂在仔猪机体免疫应答方面有辅助增强的作用,能够提高pVAX1-TGEV-S1真核表达质粒的免疫保护效果。本研究首次将TGEV S1基因与pIL-12基因的重组真核表达质粒共同免疫仔猪,观察仔猪免疫应答水平及免疫保护效果,结果显示佐剂pIL-12与TGEV S1抗原基因的联合使用,能够明显的促进机体的细胞免疫应答,也能够在体液免疫应答中发挥一定作用,从而提高机体免疫水平对抗病毒感染。为新型核酸疫苗和细胞因子免疫佐剂免疫作用和免疫机理的深入研究进一步提供理论依据。
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S858.28
【部分图文】：
1-1 TGEV 电镜照片，标尺为 100nctron microscope picture of TGEV, b毒的分类巢状病毒目，冠状病毒科，冠状病毒义 RNA 病毒，冠状病毒（Corona18,19]，危害最大就是 2002 到 2003 ；目前根据冠状病毒的抗原和遗传GEV）就属于 Alpha 冠状病毒，CCoV）等，它们在形态结构和感染（MHV）、严重急性呼吸器官综合，他们都能够引发肺炎并造成高死冠状病毒，包括鹎冠状病毒（Bulb毒的理化性质
这些多重复基因在不同的冠状病毒中其数量也不相同，例如，TGEV 有 3 个附加基因，PDCoV有 2 个，而 PEDV 只有 1 个[15,53]。1.2.2 猪传染性胃肠炎病毒结构蛋白基因TGEV RNA 基因被 N 蛋白包装成一个螺旋核衣壳。此外这个结构的作用，N 蛋白能够延长细胞周期的 S 阶段，诱导内质网应激，上调白细胞介素 8 的表达和对抗 I 型干扰素的产生[93,94]。包膜突起形状的 S 蛋白在病毒表面，介导粘合到宿主受体和膜融合，其可以分为 S1和 S2 区域，在一些冠状病毒中 S 蛋白被细胞蛋白酶或胰蛋白酶加工为 S1 和 S2 碎片[95,96]，S蛋白是病毒中和抗体产生的一个主要的靶点[97]。M 蛋白是最多的病毒粒子成分，而且含有保守的线性 B 细胞表位[98]。E 蛋白在病毒粒子的装配起重要作用，并且其能够引起内质网应激和上调白介素 18 的表达[99]。附属的基因对于病毒在体外的生长是非必须的，但是他们也许在病毒存活于感染宿主中时起重要作用，的确，TGEV 附属基因 ORF7 的产生减少了免疫系统的抗病毒防御相关基因的表达，例如干扰素的应答和炎症[67]。TGEV 3' 末端的转录样 RNA序列，鉴定为 γ 干扰素（二型干扰素）活性抑制剂调节先天免疫应答[100]，有趣的是有报道，PEDV 的非结构蛋白之一 nsp1，是一个 I 型干扰素的抑制剂[101]，而 PDCoV 缺少 nsp1 基因[15]。TGEV 有 1 个小的开放阅读框出现在下游区到 N 基因，其分别对病毒毒力和病毒复制/装配起到重要作用[102]。
ORF1a 编码的 nsp3 木瓜样蛋白水解酶和 nsp5 3C 样蛋白水蛋白（nsp），ORF1a 编码了 nsp1 到 nsp11，ORF1b 编码了构蛋白编码了重要的功能蛋白，例如 PLpro（nsp3）、3CLpro（Pol）（nsp12）和解链酶（nsp13），TGEV 有两个 PLpr（oPL1p的基因序列被频繁的用于系统发育学分析[53]。冠状病毒复制A 依赖性 RNA 聚合酶和解旋酶活性，还编码了其他酶类，例糖核酸外切酶、2' -氧-核糖甲基转移酶、核糖腺苷二磷酸 1' 聚合酶，这在 RNA 病毒中特殊而且很少见[19,138]。宿主基因表达的抑制和干扰宿主免疫应答，然而机制还不清sp1 结构信息是 β 冠状病毒 SARS-CoV 的 nsp1 氨基末端的核S-CoV 的 nsp1 能够抑制 I 型干扰素有关基因的转录和翻译， M 首次报道了 α 冠状病毒的 nsp1 结构，TGEV 的 nsp1，其边缘伴随一个长的 α 螺旋，与 SARS-CoV 的 nsp1 折叠一致p1 结构启发了冠状病毒 nsp1 有一个共同的起源，尽管缺少序 nsp1 抑制宿主基因的表达机制是不同的，对比 α 冠状病毒电、形状和氨基酸，提示不同的机制是由同源异途进化所致
本文编号：2823086
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S858.28
【部分图文】：
1-1 TGEV 电镜照片，标尺为 100nctron microscope picture of TGEV, b毒的分类巢状病毒目，冠状病毒科，冠状病毒义 RNA 病毒，冠状病毒（Corona18,19]，危害最大就是 2002 到 2003 ；目前根据冠状病毒的抗原和遗传GEV）就属于 Alpha 冠状病毒，CCoV）等，它们在形态结构和感染（MHV）、严重急性呼吸器官综合，他们都能够引发肺炎并造成高死冠状病毒，包括鹎冠状病毒（Bulb毒的理化性质
这些多重复基因在不同的冠状病毒中其数量也不相同，例如，TGEV 有 3 个附加基因，PDCoV有 2 个，而 PEDV 只有 1 个[15,53]。1.2.2 猪传染性胃肠炎病毒结构蛋白基因TGEV RNA 基因被 N 蛋白包装成一个螺旋核衣壳。此外这个结构的作用，N 蛋白能够延长细胞周期的 S 阶段，诱导内质网应激，上调白细胞介素 8 的表达和对抗 I 型干扰素的产生[93,94]。包膜突起形状的 S 蛋白在病毒表面，介导粘合到宿主受体和膜融合，其可以分为 S1和 S2 区域，在一些冠状病毒中 S 蛋白被细胞蛋白酶或胰蛋白酶加工为 S1 和 S2 碎片[95,96]，S蛋白是病毒中和抗体产生的一个主要的靶点[97]。M 蛋白是最多的病毒粒子成分，而且含有保守的线性 B 细胞表位[98]。E 蛋白在病毒粒子的装配起重要作用，并且其能够引起内质网应激和上调白介素 18 的表达[99]。附属的基因对于病毒在体外的生长是非必须的，但是他们也许在病毒存活于感染宿主中时起重要作用，的确，TGEV 附属基因 ORF7 的产生减少了免疫系统的抗病毒防御相关基因的表达，例如干扰素的应答和炎症[67]。TGEV 3' 末端的转录样 RNA序列，鉴定为 γ 干扰素（二型干扰素）活性抑制剂调节先天免疫应答[100]，有趣的是有报道，PEDV 的非结构蛋白之一 nsp1，是一个 I 型干扰素的抑制剂[101]，而 PDCoV 缺少 nsp1 基因[15]。TGEV 有 1 个小的开放阅读框出现在下游区到 N 基因，其分别对病毒毒力和病毒复制/装配起到重要作用[102]。
ORF1a 编码的 nsp3 木瓜样蛋白水解酶和 nsp5 3C 样蛋白水蛋白（nsp），ORF1a 编码了 nsp1 到 nsp11，ORF1b 编码了构蛋白编码了重要的功能蛋白，例如 PLpro（nsp3）、3CLpro（Pol）（nsp12）和解链酶（nsp13），TGEV 有两个 PLpr（oPL1p的基因序列被频繁的用于系统发育学分析[53]。冠状病毒复制A 依赖性 RNA 聚合酶和解旋酶活性，还编码了其他酶类，例糖核酸外切酶、2' -氧-核糖甲基转移酶、核糖腺苷二磷酸 1' 聚合酶，这在 RNA 病毒中特殊而且很少见[19,138]。宿主基因表达的抑制和干扰宿主免疫应答，然而机制还不清sp1 结构信息是 β 冠状病毒 SARS-CoV 的 nsp1 氨基末端的核S-CoV 的 nsp1 能够抑制 I 型干扰素有关基因的转录和翻译， M 首次报道了 α 冠状病毒的 nsp1 结构，TGEV 的 nsp1，其边缘伴随一个长的 α 螺旋，与 SARS-CoV 的 nsp1 折叠一致p1 结构启发了冠状病毒 nsp1 有一个共同的起源，尽管缺少序 nsp1 抑制宿主基因的表达机制是不同的，对比 α 冠状病毒电、形状和氨基酸，提示不同的机制是由同源异途进化所致
【参考文献】
相关期刊论文 前4条
1 边葶苈;周继勇;廖敏;;冠状病毒非结构蛋白的研究进展[J];中国动物传染病学报;2013年04期
2 贾华强;;猪传染性胃肠炎灭活细胞疫苗[J];畜牧兽医科技信息;2007年12期
3 任晓峰;尹杰超;司微;李一经;刘宝全;;猪传染性胃肠炎病毒TH-98株S基因核酸疫苗的构建及其免疫效力[J];中国兽医科学;2006年03期
4 李树根,周仲芳,李力复,林志雄,童昆周,罗长保,颜思通,陈茹;猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎弱毒二联疫苗研究[J];中国兽医杂志;2000年08期
本文编号：2823086
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