毕赤酵母表达重组猪促卵泡素的研究

发布时间：2020-09-20 21:59

　　猪促卵泡素(pFSH)是由猪垂体前叶合成分泌的糖蛋白促性腺激素,由α和β亚基组成。FSH在雌性和雄性动物性腺发育中起着决定性作用,是卵泡发育和成熟的关键。在家畜繁殖管理中,pFSH主要应用于诱导卵泡发育。由于生产效率低、半衰期短、活性不稳定等原因,pFSH在家畜繁殖管理中的应用受到限制。毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统具有产量高,纯化方式简单等优点,已广泛应用于重组蛋白的工业生产。但是pFSH在毕赤酵母的重组表达却始终面临着效率低的瓶颈,仍难以实现大规模的工业化生产。本研究旨在利用一系列分子策略,并通过优化发酵条件,提高pFSH在毕赤酵母中的分泌和表达效率。在分子策略方面,本实验分别探讨了菌株筛选、密码子优化、融合蛋白表达等对pFSH重组效率的影响。结果表明,与Muts表型菌株KM71(在甲醇培养液中生长缓慢)相比,pFSH在Mut+表型菌株GS115(在甲醇培养液中快速生长)中的表达量能够提高96%,提示GS115更适合pFSH的表达。接下来,本实验以pFSH的主要活性亚基pFSHβ为模板,探讨密码子优化和融合标签对pFSH重组蛋白表达的影响。结果表明,通过调整密码子识别效率、RNA二级结构及mRNA自由能,pFSHβ蛋白表达水平分别提高143%和22%,并初步确认密码子适应指数(CAI)大于0.8和G+C含量大于40%的条件下,pFSHβ表达效率更高。为了进一步提高融合蛋白的产量,本实验比较了不同融合标签、融合方向和融合蛋白间的连接序列对pFSHβ表达量的影响。结果显示,融合蛋白HSA-pFSHβ在毕赤酵母中的产量明显地高于蛋白pFSHβ或SUMO-pFSHβ。另外,改变HSA与pFSHβ的融合方向或者二者之间的连接序列,并不能进一步提高融合蛋白的产量。通过分析胞内蛋白,本实验发现大量重组蛋白仍残留在胞内,不能有效地被分泌到胞外,且重组蛋白在C端发生了降解。为了减少HSA-pFSHβ的降解或提高其分泌效率,本实验尝试了YPS1基因(编码的蛋白能够从C端切割碱性氨基酸)缺失性菌株或更换信号肽。结果表明,敲除YPS1基因能够减少上清中降解片段的产生,HSA或MSP信号肽能有效地将HSA-pFSHβ蛋白分泌到胞外,但是YPS1基因缺失或更换信号肽均不能进一步提高HSA-pFSHβ的胞外产量。为了验证重组蛋白的生物学活性,本实验构建了同时表达HSA-pFSHα和HSA-pFSHβ蛋白的H3-3菌株,并在H3-3菌株基础上,摸索HSA-pFSH蛋白表达的最适pH值、甲醇浓度及在高密度发酵条件下的产量。结果表明,摇瓶水平上HSA-pFSH蛋白表达的最优pH值和甲醇浓度分别在5.0-6.0和1.5-2%之间,且上清中的重组蛋白经纯化后产量可以达到40.8 mg/l;高密度发酵条件下HSA-pFSH的产量可以达到6g/l的水平,但是大量蛋白发生了降解。接下来本研究构建了稳定表达猪FSHR的HEK293细胞系(HEK293-FSHR),并通过胞内cAMP的变化来检测HSA-pFSH的生物学活性。结果显示,重组HSA-pFSH蛋白可以有效地刺激HEK293-FSHR细胞中cAMP的合成,提示重组HSA-pFSH具有生物学活性。此外,在猪卵母细胞体外成熟实验中,HSA-pFSH可以显著地刺激卵丘卵母细胞(COCs)扩张,同样证实其较好的生物学活性。另外,本实验探究了不同抗氧化剂及共表达分子伴侣对HSA-pFSHp分泌效率及产量的影响。结果表明,添加抗氧化剂A可以明显地提高HSA-pFSHβ蛋白分泌效率,而且其作用效果可能与分子伴侣或囊泡转运有关。其他抗氧化剂并没有类似的效果,提示抗氧化剂A提高重组效率的机制可能并不依赖其抗氧化活性。另外,本实验发现添加抗氧化剂A与共表达分子伴侣PDI、ERO1或BiP具有协同作用,能够将胞外HSA-pFSHβ的产量提高4-15倍。综上所述,本实验结果表明,经过一系列的分子策略和培养条件优化,重组HSA-pFSH蛋白在毕赤酵母中的分泌表达量提高15倍,为大规模重组表达pFSH提供有价值的参考。
【学位单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S828
【部分图文】：

文献综述,自然发情,促卵泡素,克隆羊

中国农业大学博士学位论文逦第一章文献综述逡逑第一章文献综述逡逑１．１研究目的和意义逡逑随着克隆羊Ｄｏｌｌｙ的诞生，体细胞克隆所需要的生物技术得到广泛的应用。其中，逡逑胚胎移植是克隆技术必要的手段和环节。如何得到大量优质的成熟卵母细胞就成了影逡逑响移植效果的关键因素。自然发情时，动物卵巢上只有１％的有腔卵泡能够发育成熟逡逑而排卵，其余９９％的发生闭锁而退化，如果在黄体期结束后，卵泡期启动之前注射外逡逑源促性腺激素，卵巢上会有更多的卵母细胞成熟并排出，这种方法称为超数排卵逡逑（Ｓｕｐｅｒｏｖｕｌａｔｉｏｎ），简称超排［１］。牛、羊超排效果较好的方法是使用了邋ＦＳＨ的逡逑ＣＩＤＲ＋ＦＳＨ＋ＰＧ法（如图１－１），但是由于促卵泡素（ＦＳＨ）的价格高，批量处理畜禽逡逑的成本大，一定程度上限制了邋ＦＳＨ在畜牧业中的广泛使用。逡逑

糖基化,酵母,异同,高尔基体

大学博士学位论文逦第一章文献９］。但是进入高尔基体后，哺乳动物细胞糖基化加工途径与酵母糖基样。酵母细胞高尔基体内蛋白加工途径比哺乳动物细胞简单，在分泌，最终加工好的蛋白的Ｎ－型糖基化为高甘露糖型糖基化，与哺乳动物有区别。这些区别可能会影响外源蛋白在酵母高尔基体的正确修饰，，阻碍毕赤酵母表达系统在生物医药中的应用。为此，Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ＼＾0２等［１１１］发现毕赤酵母可以表达与哺乳动物类似的Ｎ－型糖基化蛋白，ｂｓ等［１１２］在此基础上，成功地实现内源性糖基转移酶基因０ＣＨ１的突酶的介入，使改造后的毕赤酵母能够分泌表达与哺乳动物类似的Ｎ－。这些表达菌株能够从Ｂｉｏｇｒａｍｍａｔｉｃｓ公司购买到，网ｗｗ．ｂｉｏｇｒａｍｍａｔｉｃｓ．ｃｏｍ。逡逑

颗粒细胞,信号通路,雌二醇,生物学活性

促进卵泡的生长并排卵，故可以通过测量ｃＡＭＰ的增量或者卵丘卵母细胞扩张程度逡逑来反映ＦＳＨ的活性［５８，１５７］。另外，ＦＳＨ与颗粒细胞上的ＦＳＨＲ结合，经蛋白激酶Ａ逡逑（ＰＫＡ）促进雌二醇的产生并将其分泌到培养液中（如图１－４），因此，测量培养液中逡逑雌二醇的含量也能反映ＦＳＨ的生物学活性［６２］。除此之外，研宄人员在体外构建了稳逡逑定表达ＦＳＨＲ的细胞系，用以检测ＦＳＨ的生物学活性的研究，例如人ＦＳＨＲ的Ｙ１细逡逑１６逡逑

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