METTL3对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白和乳脂肪合成的调控及其作用机理

发布时间：2020-09-20 22:02

　　乳蛋白和乳脂肪是在哺乳动物的乳腺上皮细胞中被合成的,其合成的过程及调控是非常重要的代谢过程。乳蛋白和乳脂的合成机理是很重要的生命科学问题,近年来,越来越多的研究去揭示乳蛋白及乳脂肪合成的机理,但是研究进展却很少。现已发现mTOR信号通路主要调控乳蛋白的生成,而SREBP-1c促进脂类合成,但氨基酸和激素如何调节mTOR和SREBP-1c尚不很清楚。有研究表明,m6A甲基转移酶(methyltransferase-like protein 3,METTL3)可以通过调控mRNA中m6A甲基化水平,进而对细胞中蛋白质的合成起到重要的调节作用,但其是否能够调节乳腺中乳蛋白和乳脂肪的合成尚未见报道。本试验首次研究METTL3在牛乳腺细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)中对乳蛋白和乳脂肪的调节作用及其分子机理。本实验中,采用了组织块培养法体外培养并纯化的奶牛乳腺上皮细胞,用蛋白质免疫印记(Western blotting)和免疫荧光(Imunofluorescience,IF)检测细胞中角蛋白18(CK18)和CSN2的表达以鉴定细胞的纯度和泌乳功能。应用Western blotting检测METTL3超表达和抑制时METTL3对BMECs中乳蛋白和乳脂的影响。结果显示,当过表达METTL3时,mTOR、Gly RS、CSN2、SREBP-1c等表达量均增加p-mTOR、p-Gly RS的表达水平也有明显的升高;当抑制METTL3时,mTOR、Gly RS、CSN2、SREBP-1c等表达量均减少,p-mTOR、p-Gly RS的表达水平也有明显的降低。表明METTL3可以通过调控乳脂、乳蛋白的相关信号通路分子的基因表达进而影响乳脂、乳蛋白的合成。实验通过建立β-雌激素(E)和蛋氨酸(Met)刺激的BMECs模型,利用IF法检测添加E和Met时METTL3定位和表达变化。结果显示,METTL3主要分布在核内,添加E和Met可以上调METTL3的表达,增加METTL3的核定位。本实验选用免疫共沉淀(Co-IP)技术沉淀并鉴定了细胞中METTL3的相互作用蛋白GlyRS。结果显示,METTL3与Gly RS在胞核中结合。添加Met或E后利用siRNA对Gly RS进行干扰,应用Western blotting检测mTOR、CSN2、SREBP-1c、Gly RS、和METTL3的表达量以及p-mTOR、p-Gly RS表达水平的变化。结果显示,Gly RS干扰后,阻断了Met和E对CSN2、SREBP-1c、p-mTOR的蛋白水平的促进作用。对Gly RS进行过表达同时利用si RNA干扰METTL3,Western blotting检测发现,过表达Gly RS后mTOR、CSN2、SREBP-1c、Gly RS和METTL3的表达量明显升高,但同时干扰METTL3后Gly RS对mTOR、CSN2、SREBP-1c、Gly RS和METTL3的表达的促进作用仍然存在但明显降低,p-mTOR、p-Gly RS的表达水平也有明显的降低。这说明,Gly RS介导Met或E信号部分通过调节METTL3从而调节mTOR和SREBP-1c基因表达控制乳脂肪和乳蛋白的合成。综上所述,METTL3作为一个重要的信号分子,可以正向调节BMECs的合成。当Gly RS接受Met或E的刺激后,可以促进METTL3的表达,通过上调mTOR、SREBP-1c以及Gly RS的表达量,提高p-mTOR、p-Gly RS的表达水平以促进乳蛋白和乳脂肪的合成。
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S823
【部分图文】：

腺上皮细胞,原代培养,乳腺上皮细胞,细胞

3 结果与分析3.1 奶牛乳腺上皮细胞的培养与鉴定3.1.1 奶牛乳腺上皮细胞的原代培养与纯化经过组织块培养法培养了奶牛乳腺上皮细胞，利用细胞对胰蛋白酶的敏感度不同纯细胞。每两天换一次细胞培养液，以供应细胞生长正常的营养。当瓶内铺好小组织块培养每天观察细胞的生长状态，如图 3-1 A，当培养至大约 7 d 时，开始有成纤维细胞长出，大约 15 d 时，瓶内开始生长出乳腺上皮细胞，出现了乳腺上皮细胞和成纤维细胞混合的（图 3-1 B），当细胞长满细胞瓶底的时候，轻轻吹掉组织块，加入胰酶，利用成纤维细胰酶的敏感性使成纤维细胞悬浮，加入培养液终止消化并倒掉，经过多次纯化后得到纯腺上皮细胞（图 3-1 C），纯化后的细胞长满以后，为了能让细胞更好的生长，要对细胞传代培养。显微镜下可以看到纯化后的乳腺上皮细胞呈椭圆形，长的饱满、密集；而成细胞呈长梭型，长的分散（图 3-1 D）。

腺上皮细胞,免疫荧光,奶牛

注：FITC 标记 CK18 为红色；DAPI 染细胞核为蓝色。图 3-2 奶牛乳腺上皮细胞的 CK18 免疫荧光鉴定（×800）。2 Identification of bovine mammary epithelial cell by immunofluorescence o(×800). 蛋白质免疫印迹法鉴定 BMECs WB 检测细胞中 CK18 与 CSN2 的表达。结果如图 3-3。结果显示，在 BM2 均有表达，而成纤维细胞没有，说明成功培养出了具有泌乳功能的奶牛 Western blotting 检测奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）中 CK18 和 CSN2 的3 Detection of expression of CK18 and CSN2 in dairy cow mammary gland ecell with Western blotting.

腺上皮细胞,免疫荧光,红色,细胞

C 标记 CK18 为红色；DAPI 染细胞核腺上皮细胞的 CK18 免疫荧光鉴vine mammary epithelial cell by im(×800).法鉴定 BMECs18 与 CSN2 的表达。结果如图 3-维细胞没有，说明成功培养出了

【参考文献】