柔嫩艾美耳球虫感染鸡胚成纤维细胞差异蛋白的筛选及特性研究

发布时间：2020-09-21 09:42

　　柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)是7种鸡艾美耳球虫中的一员,具有很强的致病力。E.tenella属于严格的细胞内专性寄生虫,有着复杂的生活史,必须依靠宿主细胞才能完成其生活周期。阻止虫体入侵细胞和在细胞内的发育可能是预防和控制球虫病的有效方法。因此,鉴定与虫体入侵相关的关键分子对于开发新的抗球虫药物和疫苗具有重大作用。目前,对艾美耳球虫入侵宿主细胞机制的研究主要集中在虫体蛋白上,而与艾美耳球虫相关的宿主蛋白鲜有报道。本研究首次采用相对和绝对定量同位素标记(iTRAQ)技术结合液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术来筛选感染与未感染E.tenella子孢子72h的鸡胚成纤维(CEF)细胞中差异表达蛋白,并研究了其中的三个差异表达蛋白—脂肪酸结合蛋白4(proteins fatty acid binding protein 4,FABP4)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、原钙黏蛋白10(protocadherin 10,PCDH10)对E.tenella入侵细胞的影响,研究结果为阐明球虫与宿主相互作用的机制提供理论基础。1.基于iTRAQ技术分析柔嫩艾美耳球虫感染后CEF细胞的差异表达蛋白E.tenella是一种严格的细胞内专性寄生虫,当受到E.tenella感染时,宿主细胞会发生一系列变化以应对虫体感染。但目前,关于宿主细胞应对球虫感染机制的研究极其有限。本研究通过iTRAQ与LC-MS/MS联合技术分析了感染E.tenella子孢子72h后CEF细胞的蛋白质组表达变化,共鉴定出3967个非冗余蛋白质,与不感染组相比,感染组有259个蛋白质的表达量发生了明显变化,其中上调蛋白质145个,下调蛋白质114个。GO分析结果发现,这些差异表达蛋白主要具有结合活性、催化活性、转运子活性等分子功能。KEGG通路分析表明这些差异表达蛋白主要参与了细胞外基质受体互作、糖酵解/糖异生、粘着斑、氨基酸的生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代谢等通路。利用q-PCR对蛋白质组的数据进行验证,q-PCR结果显示7个基因的mRNA转录水平变化与iTRAQ结果一致,而1个基因的不一致。研究结果为探索寄生虫与宿主相互作用的机制提供了新的视角。2.FABP4对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵细胞的影响成功克隆了鸡FABP4基因(458-bp),并连接至pET-28c(+)载体构建了重组质粒pET-28c(+)-FABP4,诱导表达了大小为18.5kDa的重组蛋白,经Western blotting验证后确定了所获得的重组蛋白为FABP4。Western blotting和免疫组织化学结果均显示,FABP4在E.tenella子孢子感染细胞中的表达下调。而q-PCR结果显示,在E.tenella子孢子感染的DF-1细胞中FABP4的表达量上升。我们推测产生mRNA水平与蛋白水平不一致的现象,是由于存在转录后修饰或蛋白质降解等情况。抗体抑制实验表明,50、100、200、300和400μg/mL的抗FABP4抗体对子孢子入侵无明显影响。分别使用BMS-309403和转化生长因子-β3(TGF-β3)抑制和促进DF-1细胞中表达FABP4后,检测它们对子孢子入侵细胞的影响。BMS-309403处理组的入侵率未受到显著影响,而TGF-β3处理组的入侵率显著下降。结果表明宿主FABP4在E.tenella入侵中起负调控作用。3.GAPDH对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵细胞的影响成功克隆了鸡GAPDH基因(1123-bp),并构建了重组质粒pGEX-4T-1-GAPDH,表达了大小为61.7 kDa的GAPDH重组蛋白。q-PCR和免疫组织化学均显示,GAPDH在E.tenella子孢子感染的细胞中的表达显著升高。Western blotting结果显示,在E.tenella子孢子感染的细胞中GAPDH的表达量与未感染细胞无明显差异。抗体抑制实验表明,与相同浓度正常兔IgG相比,50、100、200、300和400μg/mL的抗GAPDH抗体均能明显抑制子孢子的入侵。结果表明宿主GAPDH在E.tenella入侵中起正调控作用。4.PCDH10对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵细胞的影响成功克隆了PCDH10基因(1631-bp),并构建了重组质粒pColdⅠ-PCDH10,表达了大小为63.2 kDa的PCDH10重组蛋白。Western blotting和免疫组织化学均显示,PCDH10在E.tenella子孢子感染的细胞中的表达量显著降低。抗体抑制实验表明,50、100、200、300和400μg/mL的抗PCDH10抗体对子孢子入侵无明显影响。需要更多的研究来发现PCDH10在E.tenella感染宿主细胞过程中的作用。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S858.31
【部分图文】：

细胞蛋白

学位论文第二章基于 iTRAQ 技术分析柔嫩艾美耳球虫感染后 CE 电泳泳结果显示(图 2.1)，6 个蛋白样品均条带清晰，且平行性较并且实验组与对照组间有明显的不同的条带模式，即实验组样品可用于后续分析。primer sequences (5' 3')p-AGCAGGCTTCCAGTTCATGTCTTC, lp-AAGATCACAGTCCTTGGp-GTCAATCCAGGCTGAAGATGAGAGTG, lp-GTTCCACCATCATACp-GCTGCGAGTGGATCAGGTGTAAC, lp-CGTAGTATTGGAAGGCTG

覆盖率,分子量,长度分布,定量比

术分析柔嫩艾美耳球虫感染后 CEF 细胞的差异表达蛋白14图2.2 鉴定蛋白的分子量和覆盖率分布Fig2.2 Molecular weight and distribution of coverage ratio about identificated protein2.3.2.2 鉴定肽段长度分布如图 2.3 所示，鉴定到的肽段所含氨基酸数目主要在 5~30 之间。图2.3 肽段长度分布Fig2.3 Peptide length distribution2.3.2.3 定量比值直方分布分析对质谱数据进行频数分布直方图分析，各组标签比参考标签后取 Log2 对数，见图 2.4。

长度分布,长度分布,定量比,直方图分析

2.3.2.2 鉴定肽段长度分布如图 2.3 所示，鉴定到的肽段所含氨基酸数目主要在 5~30 之间。图2.3 肽段长度分布Fig2.3 Peptide length distribution2.3.2.3 定量比值直方分布分析对质谱数据进行频数分布直方图分析，各组标签比参考标签后取 Log2 对数，见图 2.4。

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