禽流感疫苗免疫后鸭TLR2及其相关免疫因子作用的研究

发布时间：2020-09-21 12:39

　　 Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)作为机体的一种模式识别分子,通过识别入侵病原体的特定结构启动先天免疫,同时也与获得性免疫相关联,在机体发挥抵抗病原微生物感染的作用。不同TLRs识别病原体的种类不同,其中TLR2识别配体范围较广。鸭TLR2的研究一直是禽类研究的热点。本研究对绿头鸭TLR2胞外区片段进行克隆和原核表达,制备多克隆抗体,对禽流感疫苗免疫后绿头鸭组织中TLR2的表达量和组织定位进行分析,获得的结果如下:首先根据已发表的北京鸭TLR2基因胞外区序列,设计一对特异性引物,以绿头鸭脾组织为材料获得总RNA,通过RT-PCR扩增绿头鸭TLR2胞外区,得到片段长度为1788 bp,将其与pEASY-T1克隆载体连接,获得阳性重组克隆质粒经测序后,与北京鸭TLR2核苷酸序列一致,获得了绿头鸭TLR2胞外区序列;将胞外区与pET-32a原核表达载体连接,构建重组原核表达载体,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳检测,在110 KDa处,出现特异的重组蛋白。将重组蛋白与弗氏完全佐剂混合后制备免疫原,对家兔进行免疫,获得兔抗鸭TLR2胞外区多克隆抗体。进行Western blot检测获得一条110 KDa杂交带,表明该蛋白为鸭TLR2胞外区基因表达产物。采用半定量PCR技术检测实验组(禽流感疫苗免疫)和对照组中心脏、肝脏、脾脏、肺脏和胸腺组织中的TLR2 mRNA表达水平,实验组鸭TLR2均高于对照组,并且TLR2在脾脏中均高度表达,在胸腺、肝脏、肺脏中适中表达,在心脏中低度表达。实验组鸭IFN-αmRNA均高于对照组,并且脾脏中的IFN-α也高度表达,在胸腺、肝脏中适中表达,在心脏和肺脏中低度表达。表明禽流感疫苗免疫后的5种组织中TLR2及IFN-α表达量升高,且脾脏是产生TLR2的主要部位。采用免疫组化技术检测出脾脏、心脏、肝脏中均有TLR2的表达,而且实验组中鸭TLR2的表达量均高于对照组,通过Image pro软件分析脾脏是产生TLR2的主要部位,且主要分布在细胞质、细胞膜中。上述结果表明禽流感疫苗免疫后绿头鸭TLR2和IFN-α表达量均升高,其在抗原入侵机体的免疫应答中发挥重要的抗感染作用,该因子的分析为后续其功能的深入研究奠定了基础,同时也为鸭相关疾病的预防和治疗提供理论依据。
【学位单位】：哈尔滨师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.52
【部分图文】：

引带,特异性,目的,材料

2-1 脾组织中总 RNA 的提xtraction of total RNA from sp因的克隆的扩增材料，提取的总 RNA 为模A 序列设计一对特异性引带，如图 2-2 所示，目的法扩增，可获得目的基因M 1 2

RT-PCR扩增,序列,引带,特异性

图 2-1 脾组织中总 RNA 的提Extraction of total RNA from sp因的克隆的扩增材料，提取的总 RNA 为模A 序列设计一对特异性引带，如图 2-2 所示，目的法扩增，可获得目的基因M 1 2

序列,大肠杆菌,条带,序列

图 2-3 duTLR2 胞外区序列-3 : Glue recyclingof duTLR2 e子量标准 2000； 1，2：目的maker 2000; 1,2:Target gene;3:的鉴定化大肠杆菌 DH5α中，经进行 PCR 扩增，经 0.8％琼800 bp，与预期条带大小相如图 2-4 所示。0 bp0 bpM 1 2 3 4

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