PCV2真核表达载体的构建及其在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达

发布时间：2017-04-02 13:15

  本文关键词：PCV2真核表达载体的构建及其在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：利用细菌发酵和哺乳动物细胞培养系统生产复杂蛋白质所涉及的高成本使从转基因动物乳汁和尿液生成和回收重组蛋白具有巨大的吸引力和竞争力。乳腺生物反应器所获得的产物具有蛋白活性高、蛋白产量高,生产成本低等优点,是一种具有巨大潜力的生物技术,为制备商业化药用蛋白和疫苗提供了广阔的前景。猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原,每年给全世界养猪业造成了重大的经济损失。因此,PCV2抗原抗体及疫苗的研究越来越多,这为临床上有效预防猪的PCV2感染提供了坚实的保障。本论文构建了猪圆环病毒2型PCV2的真核表达载体后转染山羊成纤维细胞,建立阳性细胞克隆,为采用体细胞克隆技术进行转PCV2基因奶山羊乳腺生物反应器的制作提供生物材料。首先通过RT-PCR扩增目的基因PCV2,将其连接到真核载体PCDNA3.1,构建重组载体PCDNA3.1-PCV2,采用PCR及双酶切方法对其进行鉴定,验证所构建的真核表达载体;其次通过脂质体转染方法,将PCDNA3.1-PCV2对奶山羊胎儿成纤维细胞进行转染,利用real time-PCR及Western blotting检测,验证真核表达载体能否正确表达目的蛋白。试验结果表明:经双酶切及测序证实,pcDNA 3.1-PCV2酶切片段的长度与预期大小相符。利用脂质体介导转染和G418筛选,成功的将pcDNA 3.1-PCV2重组质粒转染到了奶山羊胎儿成纤维细胞中,得到了阳性细胞系。经RT-PCR和Western Blot检测,PCV2在奶山羊胎儿成纤维细胞中表达成功。本论文为制作奶山羊乳腺生物反应器进行PCV2蛋白的表达奠定了基础。
【关键词】：猪圆环病毒2型 PCV2 pcDNA 3.1 山羊胎儿成纤维细胞
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S827
【目录】：

• 摘要5-6
• Summary6-7
• 缩略词(Abbreviations)7-9
• 第一章：文献综述：生物反应器生产药用蛋白研究进展9-19
• 1. 引言9-10
• 2. 乳腺生物反应器10-14
• 3. 猪圆环病毒PCV-2 研究进展14-18
• 4．本研究目的及意义18-19
• 第二章 试验部分19-47
• 试验一PCV2真核表达载体的构建19-29
• 1．试验材料19-20
• 2、试验方法20-25
• 3. 结果与分析25-27
• 4．讨论27-29
• 试验二 重组质粒pcDNA 3.1-PCV2在奶山羊胎儿成纤维细胞内转染及筛选29-40
• 1．试验材料29-30
• 2、试验方法30-35
• 3. 结果与分析35-38
• 4．讨论38-40
• 试验三 阳性转基因细胞的检测与鉴定40-47
• 1．试验材料40-41
• 2．试验方法41-44
• 3. 试验结果与分析44-46
• 4. 讨论46-47
• 第三章 全文结论47-48
• 参考文献48-52
• 致谢52-53
• 个人简介53-54
• 导师简介54

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本文编号：282571