PRRSV贵州分离株GZZJ11、GZBJ12对解旋酶DDX6、Mov10的影响

发布时间：2020-09-29 19:23

　　猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),又叫“猪蓝耳病”,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种烈性传染病,在临床上主要表现妊娠母猪繁殖障碍和各年龄段猪呼吸道症状。现今猪场PRRSV多类型毒株感染较为普遍,主要有PRRSV疫苗毒株、野毒株、重组毒株和类NADC30毒株,毒株的多样性使得对该病的防控举步维艰。迄今为止,PRRSV已经在我国流行二十几年,但仍然未得到有效的控制,给我国生猪业的发展带来了难以估计的经济损失。本试验从疑似PRRSV感染的猪场分离并鉴定2株PRRSV毒株,进行全基因序列分析,在mRNA水平探究PRRSV贵州分离株对解旋酶DDX6、Mov10的影响。为初步了解贵州局部地区PRRSV感染以及毒株变异情况提供参考,也为进一步研究解旋酶DDX6、Mov10与PRRSV增殖的关系奠定基础。1.PRRSV贵州分离株GZZJ11、GZBJ12的分离与鉴定。试验对疑似PRRSV感染猪的脏器组织进行PRRS病毒分离与鉴定。取病料进行研磨、离心、除菌过滤处理后,接种于Marc145细胞,进行病毒分离;通过CPE观察、RT-PCR、IFA和Western blotting等方法对分离病毒进行鉴定。结果表明:(1)GZZJ11株在Marc145细胞上盲传至第6代后能观察到Marc145细胞出现聚团、皱缩等明显CPE,GZBJ12盲传至第3代后也能观察到相同CPE。(2)在分离病毒GZZJ11株和GZBJ12株分别盲传第6代、第3代时,RT-PCR检测到与预期相符的372 bp的N基因条带,以及931 bp的NSP2基因条带。(3)用基因2型PRRSV抗N蛋白的兔源多抗进行IFA和Western blotting试验鉴定分离毒,IFA结果显示感染病毒组能看到特异性的绿色荧光;Western blotting结果表明PRRSV感染组在15 kDa处出现特异性条带,未感染组无特异性条带。(4)GZZJ11第6代细胞培养物的TCID_(50)值为10~(-2.2)/0.1 mL,GZBJ12第3代细胞培养物的TCID_(50)为10~(-4.67)/0.1 mL。结果表明本试验成功分离鉴定出2株PRRSV,并命名为GZZJ11和GZBJ12,为后续进一步研究PRRSV相关特性奠定基础。2.PRRSV贵州分离株GZZJ11、GZBJ12全基因序列分析。采用PrimerSelect软件针对PRRSV的全基因保守区域设计13对引物,分别对2株毒株的13个基因片段进行RT-PCR、克隆至pMD-19T载体、测序、拼接,得到2株PRRSV毒株的全基因序列(去除polyA尾),采用Lasergene软件包、MEGA7.0对2株毒株的全基因序列进行比对分析。(1)RT-PCR检测到与预期大小基本相符的13个基因目的条带;拼接后分别获得GZZJ11和GZBJ12毒株全长基因组序列为15323 bp、14963 bp;全基因核苷酸比对结果表明2株毒株的全基因序列与基因1型毒株同源性在60%左右,与基因2型毒株同源性在82%以上,与HP-PRRSV代表株JXA1、HUN4、TJ核苷酸同源性在98.8%~99.2%之间。(2)2株毒株非结构蛋白和结构蛋白基因变异分析结果表明NSP2、NSP9、ORF3、ORF4和ORF5基因均有不同程度的变异,其中NSP2基因变异最大。GZZJ11株和GZBJ12株的NSP2基因分别有24、23个氨基酸突变,均有1+29个氨基酸不连续缺失,缺失位置与HP-PRRSV缺失位置一致。GZBJ12株NSP2基因除了有30个不连续氨基酸缺失外,在下游还存在120个氨基酸连续缺失,提示GZBJ12株可能演变于HP-PRRSV TJ致弱疫苗毒株TJM。(3)毒力位点分析结果表明2株毒株位于ORF5的毒力位点151位氨基酸发生了相应突变,这一位点的突变与我国分离的类NADC30毒株CHsx1401、FJXS15毒株突变一致,也与新分离的TJnh1501、GDHY、XJu-1毒株的毒力位点相同。(4)基于NSP2、ORF5以及全基因核苷酸序列遗传进化树结果表明GZZJ11株与TJnh1501、HENZZ-8等基因2型毒株遗传进化关系较近,GZBJ12株与GDHY、XJu-1等基因2型毒株遗传进化关系最近,这与全基因核苷酸序列同源性分析结果基本一致。试验结果为初步了解贵州局部地区PRRSV感染以及毒株变异情况提供参考。3.PRRSV贵州分离株GZZJ11、GZBJ12对解旋酶DDX6、Mov10的影响。通过RT-PCR从Marc145细胞中扩增DDX6、Mov10基因CDS区,并对DDX6基因CDS区进行克隆和生物信息学分析;利用q-PCR方法在mRNA水平检测贵州分离PRRSV在不同时间段感染Marc145细胞后对解旋酶DDX6和Mov10基因的影响。结果表明:(1)Marc145细胞源DDX6基因CDS全长1452 bp,编码483个氨基酸;DDX6蛋白有四个基序,含有DEAD-like解旋酶超家族结构域和C端结构域;二级结构主要以α-螺旋(37.27%)和无规则卷曲(36.44%)为主;同源性及系统进化树分析结果表明Marc145细胞源与人DDX6核苷酸同源性最高,亲缘关系最近。(2)q-PCR结果表明2株PRRSV感染Marc145细胞6 h后DDX6基因mRNA水平升高,在36 h时段差异显著;PRRSV感染Marc145细胞0 h、6 h、36 h和72 h时段Mov10基因转录水平下降,其它时段Mov10基因转录水平升高。说明贵州分离株PRRSV对解旋酶DDX6、Mov10转录水平具有一定影响。试验为进一步探究解旋酶DDX6、Mov10与PRRSV增殖的关系提供了参考。
【学位单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.651
【部分图文】：

地域分布,毒株,分支,传播路线

遗传分析结果表明此次流行毒株可能是由经典毒株演化而来(LI Y, et a2007；Zhou L, et al., 2009)。类 NADC30 毒株以 NSP2 基因存在 131 个氨基酸不连续缺失为特征(“111＋1＋19”缺失模式)，与 2008 年美国分离到 NADC30 毒株类似，因此将该类毒株命名为类 NADC30(NADC30-like)(Brockmeier S L, et al., 2012)。2014 年，周峰等(2014)首次报道了类 NADC30 在河南地区流行。随后在我国大部分地区都有类NADC30 毒株报道，且与美国的高毒力毒株 NADC30 高度同源(Zhou L, et al., 2015)，后又有多个地方有重组 NADC30 毒株的报道(Wang L J, et al., 2015)。表明类 NADC30 毒株和重组 NADC30 毒株逐渐成为我国田间流行毒株(安同庆,2017)，目前一致的看法是类NADC30 毒株是由美国传入并经历了一定时间演化而来。高嘉聪(2018)基于 NCBI 多条序列对全国 32 个省份基因 2 型 PRRSV 流行情况进行系统分型和地域分布分析，发现我国基因 2 型 PRRSV 可分为 5 个分支，HP-PRRSV 代表株位于第 8 个分支，而贵州省的主要流行毒株也是在第 8.3 分支，见图 1。

示意图,基因组结构,示意图,自剪切

图 2 PRRSV 基因组结构示意图(Lunney J K, et al., 2016)Fig.2 Schematic diagram of the PRRSV genome structure (Lunney J K, et al., 2016)4 PRRSV 主要蛋白及其功能4.1 PRRSV 主要非结构蛋白及其功能PRRSV 的 NSP1 是最早产生的非结构蛋白，不同型的 PRRSV 氨基酸的种基因 1 型有 385 个氨基酸，基因 2 型有 380 个氨基酸。NSP1 蛋白是一种多功该蛋白经自剪切后形成 NSP1α和 NSP1β，NSP1α和 NSP1β蛋白含有两个类木(Papain-like cysteine protease，PCP)，除此之外，NSP1 还包括了亚基因组 mRN需的锌指结构域。随着 NSP1α和 NSP1β的晶体结构已被解析，已经确定了NSP1β之间的自剪切位 Trp-Try-Gly203↓Ala-Gly-Lys(薛飞,2011)。NSP1 在 PRRS程中扮演着重要作用，目前报道 NSP1 蛋白可以通过 3 个不同环节或通路影响素的表达和产生，分别为 NSP1 抑制 IκB 的磷酸化而抑制 NF-κB(nuclear factor

解旋酶,基序,蛋白结构,家族

图 3 SF1 和 SF2 解旋酶家族蛋白结构与其保守基序(徐峰等，2014)Fig 3 Structure of SF1 and SF2 helicases and their conserved motifs (Xu F, et al., 2014).2 DDX6 生物学功能DDX6(又称 RCK/p54)属于 RNA 解旋酶超家族-2(SF-2)成员，也是 DEAD-box 解旋家族成员之一。DDX6 在 RNA 代谢、病毒复制、神经干细胞、泌乳、癌症、激素调等过程中发挥着重要作用。DDX6 在真核生物中具有结构和功能保守性。在结构上，DX6 蛋白由两个 RecA 结构域组成，含有对 ATP 酶和 RNA 结合活性至关重要的解旋基序，Brandmann T 等(2018)研究表明 DDX6 蛋白的 RecA 结构域可与天然免疫分子SM14 的 FDF 基序结合介导 mRNA 沉默复合体的组装。DDX6 定位于 P-Body，可与SM14、4E-T、PATL1、EDC3 等蛋白分子发生相互作用，调节 RNA 代谢(Ozgur S, et al.,015)。关于 DDX6 蛋白与病毒相关研究主要集中在丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)、

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