L-茶氨酸对骨关节炎治疗效果的观察

发布时间：2020-09-29 20:33

　　骨关节炎(OA)是常见的老龄动物多发的关节疾病,严重影响动物正常关节功能并使动物生活质量降低。临床上主要治疗方法包括手术置换、非甾体类抗炎药(NSAID)以及改善饲养管理,但是每种治疗方法都具有各自的局限性,所以急需寻找副作用小、能长期使用的药物。植物药逐渐成为近些年来的研究热点。L-茶氨酸(L-Theanine)是茶叶中的非蛋白氨基酸,具有抗炎、抗凋亡以及抗肿瘤等多种生物活性。基于此,本试验使用前十字韧带切断术(ACLT)造模的OA大鼠,将L-Theanine与非甾体类抗炎药(塞来昔布)进行对比,探究其对OA的保护效果,同时通过对患犬临床治疗试验,观察其治疗效果。试验分为在体试验、离体试验和临床治疗效果观察三部分。在体试验用ACLT造模,分为假手术组、模型组、L-Theanine治疗组(分低、中、高三个剂量)以及塞来昔布组。空白组和模型组造模之后第二天开始每天灌服1 mL生理盐水,治疗组灌胃给予L-Theanine(50mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg)持续六周;塞来昔布组于第四周开始灌服塞来昔布(2.86mg/kg),直到第六周。所有动物于6周后脱颈处死,取血清及关节软骨用于检测iNOS、NO、COX-2和PGE-2的含量;取胫骨用甲醛固定,进行HE染色及番红O-固绿染色;离体试验使用二代软骨细胞,试验分为五组:1)空白对照组2)IL-1β模型组:10 ng/mL IL-1β处理24 h;3)试验组(分三个剂量)10 ng/mL IL-1β预处理24 h后加入50μM、100μM、200μM L-Theanine共同作用24 h。Western Blot检测:COX-2、iNOS、MMP-3、MMP-13蛋白表达水平,q-PCR检测MMP-3、MMP-13,试剂盒检测细胞培养液上清中NO、PGE-2含量;临床治疗效果只观察患犬症状改善情况。在体试验结果显示造模组相对于空白组iNOS、NO、COX-2和PGE-2的含量升高,L-Theanine治疗组与造模组相比,这四个指标的表达都减少,且高剂量组(200 mg/kg)与塞来昔布组相比无显著差异;组织切片可以观察到造模组与假手术组相比软骨破坏较严重,L-Theanine治疗组和塞来昔布给药组的软骨破坏程度均较轻。离体试验结果显示MMP-3、MMP-13、COX-2、iNOS四种蛋白造模组比空白组表达显著增加,而L-Theanine干预组显示蛋白表达量下降,呈剂量依赖性;细胞培养上清中NO、PGE-2的含量造模组与空白组相比显著增加,L-Theanine治疗组其含量明显减少;临床疗效观察显示,L-Theanine能够缓解犬骨关节炎引起的关节敏感、步态强拘以及姿势异常,改善患犬生活质量。试验结果表明,L-Theanine可以减轻ACLT诱导的大鼠OA模型的炎症反应,而且可以减轻IL-1β刺激后的软骨细胞的基质降解以及降低炎症因子的表达,从而缓解骨关节炎的症状。
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S857.16
【部分图文】：

茶氨酸,化学结构式

L-茶氨酸-茶氨酸（又名谷氨酸γ-乙基酰胺，英文名 L-theanine）是茶叶中的主要氨基酸，14N2O3。它最早从绿茶中分离得到，占茶叶干重的 2%，占茶叶中游离氨基酸总]。与其他天然α-氨基酸类似，茶氨酸具有不对称碳，因此理论上具有存在 D 型，自然界中存在的茶氨酸大多为 L 型（图 1-1），其结构与 L-谷氨酸相似。同是一种安全性高、毒性很小的物质，在毒性试验中并没有发现其有毒性，因此已将其确认为一种安全物质，使用时不作限量规定[63]。L-茶氨酸具有多种生物炎作用、抗氧化作用、抗肿瘤、神经保护作用以及免疫调节作用和保护肝脏的有研究表明 L-茶氨酸可以通过减少活性氧产生和抑制 NF-κB 通路来减轻β淀粉神经中毒；也能抑制白血病的发展和肺癌细胞[65]；也可抑制 EGFR/Met-Akt/N来减缓宫颈癌细胞的生长和转移[66]，且茶氨酸本身无细胞毒性和小鼠毒性[67]；L-茶氨酸可抑制过敏性哮喘的气道炎症使 NF-κB、MMP-9 表达显著下调[68]；酸通过降低由 IL-1β和 TNF-α刺激产生的 COX-2、iNOS、细胞凋亡相关蛋白（cP）的表达抑制 CCL4 诱导的小鼠急性肝损伤[69]。因此，抑制 NF-κB 信号通路 OA 的治疗。以上研究暗示 L-茶氨酸可能对 OA 炎症反应以及基质降解具有一。

胫骨平台,标本,软骨,关节软骨

东北农业大学兽医硕士学位论文3 结果与分析3.1 在体试验结果3.1.1 软骨表面眼观变化如图 3-1，假手术组（Sham 组）关节软骨在造模 6 周后关节表面光滑、胫骨平台内、外侧均无磨损出现；手术组（ACLT 组）可见关节软骨表面粗糙，内侧胫骨平台出现磨损，色泽变暗、边缘不规整、出现软骨缺损及变薄；Celecoxib（塞来昔布）治疗组软骨面损伤较ACLT 组轻，软骨表面有不规则颗粒样磨损；L-茶氨酸治疗组（LDL、MDL 及 HDL）软骨表面眼观各组差异不明显，都出现软骨磨损、表面不光滑、关节光泽变暗。

固绿,染色切片,多糖含量,细胞外基质

图 3-3 番红 O-固绿染色切片（×100）细胞外基质中蛋白多糖含量的变化Fig. 3-3 Changes in proteoglycan content in Extracellular Matrix in Safranin O-Fast Green StainedSlice (×100)3.1.4 血清中 COX-2、PGE-2 含量的变化如图 3-4（A、B）所示，图（A）血清中 COX-2 的含量造模组相对于空白组显著增加；L-Theanine 低剂量给药组与造模组相比显著降低，中剂量组与高剂量组相比于模型组有极显著差异，COX-2 含量减少；塞来昔布给药组与模型组相比显著降低，与 L-Theanine 高剂量组相比差异不显著。图（B）所示血清中 PGE-2 含量模型组相对于空白组显著上升；低剂量给药组与模型组相比差异不显著，中剂量和高剂量给药组与模型组相比极显著降低，塞来昔布给药组与模型组相比差异极显著，PGE-2 含量明显减少。塞来昔布组与 L-Theanine 给药组相比没有显著差异。3.1.5 软骨组织中 NO、iNOS 含量的变化如图 3-4（C、D）所示，图（C）显示软骨组织中模型组 iNOS 的活力显著升高，L-Theanine

【参考文献】