调控鸡生殖干细胞分化的lncRNA筛选及PGClnc1功能机制研究

发布时间：2020-10-09 18:47

　　 生殖干细胞在有性繁殖的生物中肩负着将遗传信息在世代中传递的重要任务,通过精卵结合产生新的个体。对于具有这些特殊性质的生殖干细胞,科学家们早在十年前就致力于体外培养和诱导分化成精子和卵子的研究,试图使得精子和卵子能源源不断地通过体外分化产生,这一研究一旦取得成功,将对了解生殖细胞的发生、调控机理、遗传修饰以及临床治疗不育疾病产生深远意义的影响。多年以来,对于其发生机制的研究从未停止过,其主要涉及到关键基因、生长因子等因素的调控,而随着研究的深入,lncRNA在细胞分化中发挥的重要作用逐渐被人发现。lncRNA作为一度被忽视的角色,越来越多的研究发现,其在生物学过程中发挥着不可替代的作用。由于lncRNA在表观遗传、转录水平参与调控许多生理过程中的作用,已得到较为深刻的认知,但对生殖细胞分化的调控研究相对较少。本研究通过单细胞的高通量测序方法检测了鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)、原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)、精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)、成纤维细胞(CEFs)四种细胞的lncRNA表达模式,通过对结果的比较分析,发现胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化这一个复杂的过程中有众多的lncRNA参与其中。而PGCs作为生殖细胞的祖细胞,对其调控的研究具有重要的意义。多年以来,对于PGCs发生机制的研究一直是人们关注的热点,其中主要集中在一些内源性调控因素以及外源性活性物质,而lncRNA在PGCs的发生过程中所扮演怎样的角色,还少有报道,本研究筛选出其中在PGCs中特异高表达的lncRNA,TCONS_00948124,在 ESCs 和 SSCs 中低表达,推测该 lncRNA 可能参与了 PGCs的发育调控,将其命名为PGClnc1。为了系统地研究PGClnc1的功能与机制,本研究通过对PGClnc1进行功能性获得和缺失,旨在探索其在PGCs形成过程中的功能及其参与转录水平的调控因素;利用RNA-Pull Down,质谱分析等技术探究与其互作的蛋白及其调节方式,以及探究PGClnc1与cis预测的靶基因BTRC,两者与miRNA之间的ceRNA竞争机制:为阐明PGClnc1在PGCs形成过程中的分子调控机制提供基础依据。研究结果如下:(1)ESCs向PGCs和SSCs分化过程的lncRNA单细胞测序分析收集鸡的ESCs、PGCs、SSCs、CEFs细胞,提取RNA,进行RNA-seq,筛选出参与胚胎干细胞(ESCs)向雄性生殖细胞(PGCs、SSCs)分化过程的差异lncRNA,其中8个lncRNA与ESCs对PGC组的表达变化超过10倍,而在ESCs与SSCs组中的4个lncRNA和PGCs与SSCs组的1个相关 lncRNA 表达变化超过 10 倍,包括 STRA8,WDR91,WNT7A,PTPDC1,BARX1等。对DELs进行GO功能注释表明,超过75%的DELs富集于生物过程,包括细胞因子刺激反应、分化;超过15%DELs富集在分子功能,与miRNA、双链DNA结合有关;而超过8%的DELs富集于细胞成分,与细胞膜表面、细胞器子室相关。DELs的KEGG通路富集分析,20个信号通路显着富集于三组中,包括Jak-STAT signaling pathway和细胞因子-细胞因子受体相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、叶酸生物合成(Folate biosynthesis)、TGF-beta signaling pathway、Wnt signaling pathway 和 mTOR signaling pathway、内质网蛋白加工(Proteinprocessing in endoplasmic reticulum)、嘌呤代谢(Purine metabolism)、胰岛素信号通路(Insulin signaling pathway)和 Hedgehog signaling pathway等。在这些信号通路中,DELs 主要包括 ENSGALG00000002005、ENSGALG00000005733、ENSGALG00000002403、ENSGALG00000001967、ENSGALG00000003339、ENSGALG00000006431、ENSGALG00000006794 等。荧光定量 PCR 检测结果显示这些lncRNA的表达量与RNA-seq结果相一致。(2)PGClnc1的筛选与鉴定对筛选获得的差异lncRNA进行分析后发现,在ESCsvs PGCs、ESCs vs SSCs 和 PGCs vs SSCs 组分别有 354,654 和 239 个特异 novel lncRNA;且共有367个特异表达lncRANA参与生殖细胞分化,其中包括ENSGALG0000000038,ENSGALG0000015297,ENSGALG0000011415 等;KEGG 通路富集结果表明 XLOC_612989(ACVR2A)、XLOC_478357(Lef-1)、XLOC_225283(MAPK1)等 lncRNA 能够显著的富集于18条参与雄性生殖细胞分化的关键信号通路,如TGF-β,Notch和Jak-STAT等信号通路;其中PGCs特异表达的lncRNA(TCONS_00948124)显著富集于TGF-β signaling pathway,命名为PGClnc1;表达谱检测结果表明:PGClnc1在性腺中高表达,且主要表达于细胞质中,扩增PGClnc1的4个开放阅读框(ORF2、ORF3、ORF6、ORF8),连接带有his标签的原核融合表达载体pET28a(+)载体,经IPTG诱导细菌蛋白进行Western Blot检测,发现PGClnc1的ORF2可诱导表达his标签蛋白,进而确定PGClnc1具有编码小肽的能力。(3)启动子调节PGClnc1差异表达结合NCBI和UCSC数据库,确定PGClnc1转录起始位点上游1500bp左右的序列为PGClncq1启动子并克隆,置换扩增pEGFP--N1载体中的CMV启动子,将重组载体pPGClnc1-EGFP进行体外转染DF-1细胞,绿色荧光能够正常表达,说明克隆的PGClnc1启动子区域具有活性.,通过缺失片段克隆技术,构建PGClnc1启动子不同缺失片段载体PGL3-P1～PGL3-P6,并通过双荧光素酶报告系统检测发现PGClnc1启动子核心区域为-1033～-661bp;PGClnc1启动子核心区域存在STAT1、TCF7L2、Sox2转录因子结合位点,对这些位点进行点突变实验同时构建相应转录因子点突变载体,通过双荧光素报告系统检测发现这些转录因子对启动子的活性都有一定的正向调控作用,其中TCF7L2作用极显著;利用5-Azadc(1Oμmol/L)、TSA(1μmol/L)处理转染PGL3-P1的DF-1细胞,发现DNA甲基化抑制剂5-Azadc以及组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理后,PGClnc1启动子活性由8.36±3.33上升至68.99±2.29、141.7±3.12,表明降低DNA甲基化水平和提高组蛋白乙酰化水平能够提高PGClnc1启动子活性。(4)PGClnc1在PGCs形成过程中的功能针对PGClnc1序列设计3个shRNA靶位点,构建慢病毒干扰载体,并进行慢病毒包裹,以qRT-PCR检测慢病毒干扰载体的干扰效率。成功构建干扰载体PGClnc1-sh1、PGClnc1-sh2和PGClnc1-sh3,干扰效率分别为29%±0.04、77%±0.02和47%±0.05(P0.01),通过体内和体外两个水平研究PGClnc1在PGCs形成过程中的功能,结果显示:体外实验过程中,在过表达组诱导4天后能出现生殖样细胞,且生殖标记基因有显著性的上调表达,敲除组在相同的情况下则不能。流式细胞分选结果表明,在第4d,正常诱导分化的细胞中类PGCs样细胞所占比例为4.5%±0.19,而在过表达PGClnc1后,比例上升至5.9%±0.21(P0.01),相对地,敲低PGClnc1后,比例显著下降至1.1%±0.2(P0.01)。荧光定量实验结果也显示PGClnc1敲低后PGCs的标记基因cvh的表达(0.3412±0.03)与正常组(1.02454±0.03)相比出现了显著的下调(P0.01);间接免疫荧光结果显示,相对于RA诱导组,过表达PGClnc1后CVH蛋白表达增加,而在敲低PGClnc1后,CVH蛋白表达却显著下降;体内实验过程中,鸡胚注射慢病毒载体10μL 106TU/mL+90μLDMEM,注射后能够稳定表达EGFP且鸡胚能够激发绿色荧光。qRT-PCR结果显示在敲低PGClnc1后,cvh、c-kit生殖相关基因大幅度下降到0.245±0.199、0.17±0.0458,过表达PGClnc1,体内各个基因的表达量发生了相反的变化,其中 cvh、c-kit大幅上升至 0.67±0.02、0.85±0.01(P0.05);PAS 结果显示敲低 PGClnc1能够显著降低PGCs的产生。流式细胞分选结果显示,在control组中cvh阳性细胞率所占比例为4.2%±0.21,而在过表达PGClnc1后,cvh阳性细胞率所占比例上升至5.8%±0.15(P0.01),相对地,敲低PGClnc1后,cvh阳性细胞率所占比例下降至1%±0.19(P0.01)。(5)PGClnc1调节PGCs形成过程的分子调控机制探究对PGClnc1的序列进行RNA-pull down和质谱分析,成功获取23个与PGClnc1互作的蛋白,其中包括GAPDH,KRT5,KRT19,LOC776816等已知蛋白以及其他未知蛋白;GAPDH参与调控TGF-β信号通路的信号转导,与本实验室前期对TGF-β信号通路对生殖细胞分化影响的结果相结合,并且对PGClnc1进行干扰或过表达后,发现Smad3基因呈现显著地反向变化趋势,两者存在一种负向调控关系(分别上升至3.52±0.089和下降至0.50±0.026),Smad3蛋白表达变化趋势与mRNA水平一致,同时结合RIP实验发现,干扰PGClnc1后会在磷酸化水平上对GAPDH的蛋白表达造成影响,进而从蛋白水平上行使功能;然后针对性地对PGClnc1与miRNA的竞争结合机制进行探究,发现PGClnc1和其cis预测的靶基因BTRC具有结合靶点的miRNA是gga-mir-6557-5p,将miRNA的模拟物与抑制物,与PGClnc1的干扰过表达载体共转染DF-1细胞发现,干扰PGClnc1,靶基因表达下调至0.257±0.020;过表达miR,BTRC表达下调至0.566±0.019。干扰BTRC,PGClnc1表达下调至0.788±0.031;过表达miR,PGClnc1表达下调至0.574±0.025,而过表达PGClnc1,过表达miR,BTRC表达上调至 1.257±0.028。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S831
【部分图文】：

图２－１邋ＩｎｃＲＮＡ筛选流程图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１邋ＩｎｃＲＮＡ邋ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ邋ｐｒｏｃｅｓｓ逡逑１．４．４．４．１基本师选逡逑

ｉｓ邋ｎｏ邋ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．逡逑２．５邋ＲＮＡ－ｓｅｑ整体质量评估逡逑通过比较不同样品之间定量结果的箱形图和密度分布图（图２－５、图２－６），直观观察到各逡逑组样品整体表达水平上的差异，本研宄对ＥＳＣｓ、ＰＧＣｓ、ＳＳＣｓ、ＣＥＦｓ四种样本，对每种样品逡逑的表达量进行统计，对每种样本的ＦＰＫＭ值，利用箱型图和密度分布图进行统计呈现，发现逡逑每种样本的整体数据的表达量符合ｌ0ｇｌ0（ＦＰＢＣＭ＋ｌ）＞０，可用于后续的分析筛选。逡逑ＦＰＫＭ邋ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ逡逑６－邋：邋８逡逑＾邋Ｊ逦：逦：逡逑ｇ逦；逦丨逦：逦Ｇｒｏｕｐ逡逑＾４＂逦Ｉ逦白邋ＥＳＣｓ逡逑ｇ－逦串邋ＰＧＣｓ逡逑５＾逦§ＣＥＦ逡逑0）逦＾ＳＳＣｓ逡逑－２逡逑２－逡逑Ｉ…逦１逡逑逦邋逦逡逑０－邋逦邋￣Ｉ￣邋邋１邋邋￣Ｉ￣￣逡逑＜＾＞邋＜＾＞逦＾逦＜§＞逡逑图２－５邋ＦＰＫＭ箱型图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－５邋ＦＰＫＭ邋ｂｏｘ邋ｄｉａｇｒａｍ逡逑注：本研究利用的ＦＰＫＭ是每百万ｆｒａｇｍｅｎｔｓ中来自某一基因每千械基长度的ｆｒａｇｍｅｎｔｓ数目，其同时考虑逡逑了测序深度和基因长度对ｆｒａｇｍｅｎｔｓ计数的影响，是目前最为常用的基因表达水平估算方法。横坐标为样品逡逑名称，纵坐标为ｌｏｇｌ０（ＦＰＫＭ＋ｌ），每个区域的箱型图对五个统计量（至上而下分别为最大值，上四分位数，逡逑中值

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本文编号：2834058