新城疫病毒M蛋白与鸡importin β1蛋白的相互作用鉴定

发布时间：2020-10-09 22:51

　　新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是一种有囊膜、含有单股负链不分节段基因组的RNA病毒,其基因组至少编码六种病毒蛋白。基质蛋白(matrix protein,M)是NDV基因组编码的一种非糖基化膜相关蛋白,位于病毒囊膜内表面,构成病毒核衣壳蛋白和囊膜连接的支架。与大多数副黏病毒M蛋白一样,NDV M蛋白是一种多功能病毒蛋白,同时也是一种细胞核-细胞质穿梭蛋白。本课题组前期通过荧光共定位试验发现importinβ1蛋白缺失体与NDV M蛋白共表达后导致M蛋白不能进入细胞核,并且免疫共沉淀试验发现importinβ1蛋白能与M蛋白发生相互作用,暗示importinβ1蛋白可能是NDV M蛋白入核转运的核转运受体蛋白。由于免疫共沉淀试验不能反映蛋白之间的直接相互作用,因此需要进一步用其它试验来验证。目前,pull-down技术被广泛应用于蛋白质之间在体外的直接相互作用研究。因此,本研究通过构建NDV M基因和鸡importinβ1基因的重组原核表达载体,利用原核表达系统获得重组蛋白,然后通过GST pull-down技术验证NDV M蛋白与鸡importinβ1蛋白之间的相互作用。1鸡importinβ1基因的克隆与序列分析根据Gen Bank登录的鸡importinβ1基因序列(XM_015299473)设计合成特异性引物,通过RT-PCR从DF-1细胞中扩增importinβ1基因CDS区并进行克隆和测序,利用生物信息学工具对其理化性质、二级结构、亚细胞定位和系统进化树进行分析。结果表明,鸡importinβ1基因CDS全长2268 bp,共编码755个氨基酸,编码的蛋白等电点为4.61,相对分子质量84.15 k Da,分子式为C3712H5901N979O1152S46。蛋白质二级结构预测显示,鸡importinβ1蛋白含有丰富的二级结构,以α螺旋为主(占64.90%),亚细胞定位预测发现该蛋白定位于细胞质。importinβ1基因同源性及系统进化树分析结果表明鸡与鹌鹑的亲缘关系最近。2鸡importinβ1基因重组原核表达载体的构建与表达本研究以重组质粒p CR2.1-importinβ1为模板,用鸡importinβ1基因的特异性引物进行PCR扩增,胶回收目的基因并将其亚克隆至原核表达载体p ET-32a(+),构建重组原核表达载体p ET-32a-importinβ1。将测序正确的重组原核表达载体p ET-32a-importinβ1转化大肠杆菌BL21(DE3),对IPTG浓度、诱导温度和诱导时间进行优化,以确定重组蛋白的最佳表达条件。结果表明,成功构建重组原核表达载体p ET-32a-importinβ1,经IPTG诱导表达及条件优化,确定当IPTG终浓度0.1m M、温度37℃、诱导时间4h时目的蛋白的表达量最高,并且在大肠杆菌中的目的蛋白分子量约为97 k Da,与预期大小相一致。对目的蛋白表达形式研究结果发现,His-importinβ1重组蛋白以可溶性和包涵体形式存在。3 NDV M基因重组原核表达载体的构建与表达本研究以实验室保存的重组质粒p CMV-HA-M为模板,利用NDV M基因特异性引物进行PCR扩增,胶回收目的基因后进行双酶切,然后将其与经过同样双酶切的原核表达载体p GEX-6p-1连接,转化大肠杆菌,提取质粒进行酶切鉴定,以此构建重组原核表达载体p GEX-6p-M。将测序正确的重组原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,对IPTG浓度、诱导温度和诱导时间进行优化,以确定最佳表达条件。结果表明,成功构建重组原核表达载体p GEX-6p-M,经IPTG诱导表达及条件优化,确定当IPTG终浓度0.1m M、温度37℃、诱导时间5h时目的蛋白的表达量最高,并且在大肠杆菌中的目的蛋白分子量约为68 k Da,与预期大小相一致。对目的蛋白表达形式研究结果发现,GST-M重组蛋白主要以包涵体形式表达。4 GST Pull-down验证NDV M蛋白与鸡importinβ1蛋白的相互作用本研究对包涵体GST-M重组蛋白首先进行变性和复性处理,以获得有活性的GST-M重组蛋白。然后以GST-M重组蛋白为诱饵蛋白,His-importinβ1重组蛋白为猎物蛋白,利用GST pull-down技术验证M蛋白与importinβ1蛋白的相互作用。结果表明,利用蛋白重折叠试剂盒获得了有活性的GST-M重组蛋白,将其作为诱饵蛋白,可以捕获并检测到His-importinβ1重组蛋白,但是GST标签蛋白不能结合His-importinβ1重组蛋白。以上结果说明GST pull-down技术证实NDV M蛋白与鸡importinβ1蛋白在体外具有直接的相互作用,这为深入研究importinβ1蛋白在NDV M蛋白细胞核定位的分子机制以及在NDV复制和致病中的作用奠定了基础。
【学位单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：

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图 1 不同物种 importin β1 蛋白结构示意图Fig.1 The structure scheme of importin β1 of different species目前，国内外对人类 importin β1 蛋白的结构和功能研究较为深入。在第 21~101 位氨基酸区域为 IBN_N 结构域，可以与 Ras 相关蛋白（ras related nuclear protein，Ran）结合；而第 2~873 位氨基酸区域包含 18 个 HEAT 结构域，该结构域可形成 2 种α-螺旋结构（A 螺旋和 B 螺旋）（图 2），其作用是通过伸展或收缩改变其构象，为与其它细胞蛋白或病毒蛋白的相互作用提供丰富的结合位点（Tauchert MJ, et al, 2016）。虽然importin β1 基因被认为是“管家基因”，但它并不在人类的所有组织中均匀表达。研究发现，importin β1 基因在积极增殖的组织，如肿瘤、睾丸、干细胞和淋巴细胞等显现出相对高的表达；利用 MAPPER 计算工具预测的特化蛋白 1(specificity protein 1，SP1)、核因子 E2 相关因子 2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2, NRF-2)、环-螺旋蛋白1(helix-loop-helix protein 1, HLH-1)、Ras 应答元件结合蛋白 1(ras responsive elementbinding protein 1, RREB-1)、CAAT 框(CAAT box)等转录因子结合位点可能

序列,非经典,三维结构图,经典

经典和非经典 NLS 序列及其三维结构图（根据参考文献修改，Lott K, et he amino acid sequences and three-dimensional structures of classical and non-(modified from reference, Lott K, et al, 2011)明，importin β1 蛋白结合靶蛋白在穿过 NPC 的过程中还需要 R, et al, 2015; Raices M, et al, 2017）。Ran 是一种小 G 蛋白，在细调节因子 1(regulator of chromosome condensation 1, RCC1)、Ran GTPase activating protein, RanGAP) 等共同调控 importin β1 介导佩伟，等，2011）。随着研究的深入，importin β1 直接介导的靶渐清晰，其具体过程如图 4 所示（Harel A, et al, 2004）：在细胞1 识别靶蛋白 NLS 并结合形成 importin β1-靶蛋白二元复合物，接基与 RanGDP 结合形成靶蛋白-importin β1-RanGDP 三元复合物复合物中的 RanGDP 与 NPC 上的核孔蛋白 NTF2 结合，导致 NP细胞核外侧的核孔蛋白变位到细胞核内侧，这时与核孔蛋白结合

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2018 届硕士研究生学位论文靶蛋白留在细胞核内，importin β1-RanGDP 中的 RanGDP 在染色体浓缩调节因子 RCC1作用下，又被 RanGTP 替代形成 importin β1-RanGTP 复合物，并穿过 NPC 进入细胞质。在细胞质内，importin β1-RanGTP 被 RanGAP 水解成 importin β1 和 RanGDP。此时，在细胞质中新合成的或解离出的 importin β1 和 RanGDP 等待新一轮靶蛋白的入核转运。研究表明，理论上如果某蛋白能与核孔复合体上的 FG 重复序列结合，则该蛋白就能不依赖于 importinα/β而进行入核转运，例如β-Catenin（Eun-Kyung Suh, et al, 2003）。在靶蛋白的入核转运过程中，细胞内 importin β1 蛋白质水平的升高多见于癌细胞（van der Watt PJ, et al, 2009; Angus L, et al, 2009），这是由于癌细胞增殖所需的货物，如组蛋白、糖皮质激素受体和 RNA 等需要 importin β1 给予大量转运。因此，这一发现使得 importin β1 逐渐成为抗癌药物新靶点。

【参考文献】