紫花苜蓿细胞分裂素氧化酶基因（MsCKX）的克隆及初步功能分析

发布时间：2020-10-10 02:18

　　紫花苜蓿(Medicago Sativa L.)作为优质的豆科牧草,在畜牧业发展中占据着重要的地位。但是在我国,紫花苜蓿种植面积最大的西北地区降水量少,土壤盐碱化等环境因素导致了紫花苜蓿产量较少,品质偏低的后果,严重制约了畜牧业的发展。因此,培育出优良、抗逆性强的紫花苜蓿品种势在必行。有研究表明,细胞分裂素氧化酶基因作为一种逆境响应因子参与植物的抗逆反应。研究细胞分裂素氧化酶基因的相关功能,利用人工手段控制紫花苜蓿Qg源细胞分裂素水平,是对紫花苜蓿抗逆性进行改良的一种有效的生物技术策略。本研究利用同源克隆法克隆了紫花苜蓿细胞分裂素氧化酶基因MsCKX,并利用生物信息学软件对其进行序列分析,对其分子功能进行了推测;利用实时荧光定量技术分析了MsCKX基因在干旱、盐以及ABA等不同处理下在不同组织中的表达模式;构建了植物过表达载体pCAMBIA1302-MsCKX,利用农杆菌介导法将其导入到拟南芥中,成功获得了MsCKX转基因拟南芥植株,并对转基因拟南芥进行了初步功能的研究。现将主要研究结果如下:1.紫花苜蓿MsCKX基因的cDNA全长为1833 bp,包含1530 bp的开放阅读框,编码509个氨基酸残基。信号肽预测显示MsCKX基因编码蛋白不含有信号肽,可能在细胞质中行使功能。对其保守结构域分析发现其氨基酸残基可以构成CKX家族共有的核心功能域:细胞分裂素、FAD以及细胞分裂素氧化酶I结合域,结合FAD/FMN的脱氢酶保守域以及与FAD连接的氧化还原酶保守域。2.紫花苜蓿MsCKX基因在根和叶片中均有表达,并且在叶片中表达量最高,是根中表达量的16倍。经ABA,NaCl及干旱处理后发现,MsCKX基因的表达会随着组织及环境刺激的不同发生不同的变化,表达模式及表达量变化幅度较大。但是不论怎么变化,MsCKX基因对各种胁迫都有响应,说明MsCKX基因可能会参与ABA,NaCl及干旱胁迫的调节过程。3.对转基因拟南芥T3代植株在种子萌发和非生物抗性(抗旱和耐盐)两方面进行初步功能的验证发现,MsCKX基因对种子萌发具有负调控作用,延迟了其萌发并通过促进根的生长来提高了其耐盐性和抗旱性。综上所述,本研究通过生物信息学、表达模式研究以及转基因分析,验证了紫花苜蓿MsCKX基因初步的功能,为后期紫花苜蓿的抗逆研究奠定了一定的基础。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S541.9
【部分图文】：

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基因的生物信息学分析I ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 进行 CKX 基因的核酸序列ORF) 以及蛋白理化性质的的预测分析。此外通过采用专用w.expasy.org/tools/) 进行推演氨基酸的二级结构预测，asy.org/protscale/) 进行亲水性/疏水性预测。利用 DNAMAN基酸序列比对及系统进化树构建。析 RNA 提取质量检测究采用的 RACE 技术对 RNA 质量要求高，因此对所提取的标仪检测其OD值发现，OD 260/OD 280均介于1.8-2.0，浓提 RNA 质量较好，没有蛋白和其他杂质污染。经 1%琼脂糖 2-1)，所提 RNA 完整性较好，可用于后续试验。

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的序列长度分别为529 bp和476 bp。将两段序列及中间片段序列用DNAMAN软件拼接在一起，并根据拼接的序列设计全长引物进行扩增，通过测序获得1833 bp的基因全长序列，其ORF区长度为1530 bp (图2-2)。18

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图 2-3 MsCKX 基因的 CDS 核苷酸及氨基酸序列(方框中表示起始密码子和终止密码子)ding sequence (CDS) and deduced amino acid sequence of (Start codon and stop codon are boxed)

【参考文献】