碳酸酐酶4的基因工程表达及其表达产物对鸡精子活力的影响
发布时间：2020-10-10 03:07
禽类输卵管的子宫阴道交接部和伞部存在着一种特殊的管状腺,这种腺体能使禽类精子在输卵管内长期存活,并且能够长时间保持其受精力,该腺体被称为贮精腺。禽类贮精腺能够大量表达碳酸酐酶,且碳酸酐酶4(CAⅣ)在哺乳动物精子成熟和储存的附睾部位大量表达,据此推测CAⅣ基因可能影响着母鸡体内精子的贮存。本试验以鸡为研究对象,参考鸡CAⅣ基因序列,根据基因序列的保守区设计特异性引物,内参基因选择鸡β-actin基因,用荧光定量分析CAⅣ基因在鸡输卵管伞部、膨大部、峡部、子宫部、子宫阴道交接部和阴道部的表达。结果表明子宫阴道交接部的CAⅣ基因表达量最高,显著高于其他部位的表达(p0.05);伞部次之,其表达量显著高于除子宫阴道交接部之外的其他部位(p0.05);而在其他四个部位表达量都比较低。CAⅣ基因在母鸡输卵管子宫阴道交接部和伞部位的高表达预示着其可能参与贮精腺内的精子储存。根据鸡CAⅣ的序列以及毕赤酵母的密码子的喜好性,合成CAⅣ基因,将CAⅣ基因克隆到p PICZαA真核表达载体中,并将重组表达质粒电转至毕赤酵母菌GS115中,得到含重组质粒的毕赤酵母菌,用终浓度为1%的甲醇诱导重组阳性菌的表达,通过SDS-PAGE电泳和His标签蛋白表达的Western Blot检测表达产物。用Ni离子亲和层析纯化表达产物,并用SDS-PAGE电泳和Western Blot检测纯化后的表达产物。结果表明重组酵母菌能成功分泌鸡CAⅣ蛋白,约为36k Da,且用Ni离子亲和层析法纯化可获得纯度较好的目的蛋白。在鸡精液内添加CAⅣ蛋白测定在不同的贮存时间下精液的p H值和精子活力的差异。结果发现,随着精液贮存时间的推移,两组精液的p H值和精子活力均显著下降(p0.05);在精液贮存的6 h、12 h和24h时,添加CAⅣ蛋白组p H值显著低于对照组(p0.05);在精液贮存的12 h和24h时,添加CAⅣ蛋白组精子活力显著低于对照组(p0.05)。结果表明CAⅣ蛋白可能通过调节贮精部位的p H值和精子活力来抑制精子运动。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S831
【部分图文】：
图 2-1 总 RNA 的质量检验Fig.2-1 Organize total RNA detection results大部，C 为峡部，D 为子宫，E 为子宫阴道agnum, C is isthmus, D is uterus, E is utero-v定产物进行 PCR 扩增，扩增产物在 2%个部位都有反转录扩增产物（图 2-2）系和反应条件可以用于荧光定量研究图 2-2 CAⅣ基因反转录扩增结果
图 2-1 总 RNA 的质量检验Fig.2-1 Organize total RNA detection resultsB 为膨大部，C 为峡部，D 为子宫，E 为子宫阴道交接部, B is magnum, C is isthmus, D is uterus, E is utero-vagina ju的确定反转录产物进行 PCR 扩增，扩增产物在 2%的琼脂管六个部位都有反转录扩增产物（图 2-2），且条扩增体系和反应条件可以用于荧光定量研究。
图 2-4 CAⅣ基因在鸡输卵管不同部位中的相对表达量ig.2-4 Relative expression levels of CAⅣ mRNA in different tissues of oviduct in chicken柱状图上面字母相同者表示差异不显著（p>0.05），字母不相同表示差异显著（p<0.05）讨论本试验通过实时定量 PCR 分析 CAⅣ基因在 mRNA 水平母鸡输卵管不同部达，结果表明 CAⅣ基因的在子宫阴道交接部位表达量最高，显著高于母鸡其它部位，其次为伞部，且伞部 CAⅣ的表达含量也显著高于除子宫阴道交其它部位，而其他四个部位之间的 CAⅣ的表达没有差异。母禽生殖道内的有两个部位，一个是子宫阴道交接部，另一个是伞部，子宫阴道交接部的贮母鸡贮存精子的主要场所(Froman 2003)，在此部位贮存的精子释放并向上运部短暂贮存并在此完成受精 (King et al 1999)。CAⅣ在母鸡生殖道贮存精子
本文编号：2834630
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S831
【部分图文】：
图 2-1 总 RNA 的质量检验Fig.2-1 Organize total RNA detection results大部，C 为峡部，D 为子宫，E 为子宫阴道agnum, C is isthmus, D is uterus, E is utero-v定产物进行 PCR 扩增，扩增产物在 2%个部位都有反转录扩增产物（图 2-2）系和反应条件可以用于荧光定量研究图 2-2 CAⅣ基因反转录扩增结果
图 2-1 总 RNA 的质量检验Fig.2-1 Organize total RNA detection resultsB 为膨大部，C 为峡部，D 为子宫，E 为子宫阴道交接部, B is magnum, C is isthmus, D is uterus, E is utero-vagina ju的确定反转录产物进行 PCR 扩增，扩增产物在 2%的琼脂管六个部位都有反转录扩增产物（图 2-2），且条扩增体系和反应条件可以用于荧光定量研究。
图 2-4 CAⅣ基因在鸡输卵管不同部位中的相对表达量ig.2-4 Relative expression levels of CAⅣ mRNA in different tissues of oviduct in chicken柱状图上面字母相同者表示差异不显著（p>0.05），字母不相同表示差异显著（p<0.05）讨论本试验通过实时定量 PCR 分析 CAⅣ基因在 mRNA 水平母鸡输卵管不同部达，结果表明 CAⅣ基因的在子宫阴道交接部位表达量最高，显著高于母鸡其它部位，其次为伞部，且伞部 CAⅣ的表达含量也显著高于除子宫阴道交其它部位，而其他四个部位之间的 CAⅣ的表达没有差异。母禽生殖道内的有两个部位，一个是子宫阴道交接部，另一个是伞部，子宫阴道交接部的贮母鸡贮存精子的主要场所(Froman 2003)，在此部位贮存的精子释放并向上运部短暂贮存并在此完成受精 (King et al 1999)。CAⅣ在母鸡生殖道贮存精子
【参考文献】
相关期刊论文 前2条
1 崔成都;鲁京兰;金清诛;朴明椒;权福实;;禽类输卵管精子腺组织学与组织化学研究[J];动物医学进展;2010年10期
2 赵翔,张梅芬;番鸭输卵管内贮精腺体超微结构的观察[J];畜牧兽医学报;1997年06期
本文编号：2834630
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