变异黄芪内生真菌的诱变及SW合成突变菌株的筛选

发布时间：2020-10-12 07:42

　　 疯草(Locoweed)是含有苦马豆素(swainsonine,SW)的豆科棘豆属和黄苗属有毒植物的统称,动物过量采食后表现出共济失调、跛行、瘫痪等临床症状。疯草内存在波状芽管蠕孢菌(Undifilumspp),该真菌与疯草中的毒性成分SW密切相关。研究该内生真菌中SW合成的路径,可以为调控疯草脱毒奠定基础,并提供理论依据。目前,疯草内生真菌合成SW的具体途径仍不确定,SW的提取率也较低,通过诱变手段可以有效调控SW的产率,为SW的进一步研究奠定基础。本试验主要对变异黄芪种子中的产SW内生真菌进行分离与鉴定,使用该内生真菌制备原生质体,并进行转化及再生,对该内生真菌进行诱导选育,为进一步阐明SW的合成机理及突变菌株的选育提供理论基础。1、从变异黄芪种子中共分离到3株能够产生SW的内生真菌,经过ITS、GPD序列的同源性比对和遗传进化分析,结果表明该菌株与波状芽管蠕孢菌的亲缘关系最近,根据形态结构和遗传进化分析结果将NM-UA001、NM-UA002、NM-UA003 3株菌鉴定为U.oxytropis。2、选取液体培养15d的NM-UA003菌丝,充分研磨后,使用0.6mol/L MgSO4作为缓冲液,酶解体系为纤维素酶+溶壁酶+蜗牛酶,3种酶组份的比例为1:1:1.2,室温下90 r/min振荡酶解2 h,U.oxytropis原生质体的生成量最大,达到8×107～1.2×108个/mL。采用真菌表达载体pAN7、pDL2、pFL2对疯草内生真菌原生质体进行体外转化,转化后可以在再生培养基上生长。3、分别选用UV和EMS、NTG诱变剂对内生真菌进行诱变,随机挑取79株诱变处理的菌株进行富集培养。各菌株SW合成效率分析结果表明,UV诱变处理,共获得6株SW产率发生显著变化的突变株(P0.05);使用EMS诱变处理时,共获得12株SW产率显著变化的突变株(P0.05);使用NTG诱变处理时,共获得8株SW产率发生显著变化的突变株(P0.05)。
【学位单位】：宁夏大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S852.662
【部分图文】：

Ｌ－哌可酸??１－氧吲哚里西啶?ｈ?？?Ｉ?（ｌＳ．８ａＳ）￣＾基吲哚里西啶??图１－１豆类丝核菌中苦马豆素和根霉菌胺的合成途径ｌ４５４６ｌ??Ｆｉｇ?１－１?Ｔｈｅ?ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｐａｔｈｗａｙ?ｏｆ?ｓｌａｆｒａｍｉｎｅ?ａｎｄ?ｓｗａｉｎｓｏｎｉｎｅ?ｉｎ?Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ?ｌｅｇｕｍｉｎｉｃｏｌａ??金龟子绿僵菌是一种寄生于动物体内的病原，属Ｔ半知菌亚门绿??僵菌属。１９８５年，Ｈｉｎｏ等首次从该中分离出一种具有免疫活性的生物碱，??随后证实该生物碱即是ＳＷ。Ｓｉｍ等Ｍ推测绿僵菌合成ＳＷ的前体物质可能是Ｌ－赖氨酸或者Ｌ－??哌可酸，进行了更加深入的研宄，发现当增加Ｌ－赖氨酸的浓度时，Ｌ－哌可酸浓度也随着增加，ＳＷ??的合成量也增加。ａ－酮戊二酸和Ｌ－赖氨酸经过一些列反应后都会生成一种共同的物质，即Ａｌ，６－??哌啶甲酸，Ａ１，６－哌啶甲酸经转化形成Ｌ－哌可酸，Ｌ－哌可酸在某些物质催化作用下，最终生成ＳＷ。??因此，认力ＡｔｏａｒＷｚ／ｗ／ｗ麵＞〇／？／／此合成ＳＷ的部分路径与／ｅｇｗＨ／？／ｃｏ／＜３相似（见图丨－２?）。??Ｌ－赖氨酸??ａ－酮戊二酸?Ｌ－酵母氨酸??高柠檬酸?ｔｘ－氨基已二酸??？?Ａｌ

?Ｃｔ－酮己二酸?苦马豆素??图１－２金龟子绿僵菌中ＳＷ的合成途径Ｉ４７】??Ｆｉｇ?１－２?Ｔｈｅ?ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ?ｐａｔｈｗａｙ?ｏｆ?ｓｗａｉｎｓｏｎｉｎｅ?ｉｎ?Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ?ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ??Ｌ－赖氨酸和Ｌ－脈可酸是７？／７／‘Ｚ０ｍｗ／ｗ?／叹麵／／７／（：〇／〇和６７／７／５０／？／／似合成ＳＷ的共同的??前体物质，Ｌ－赖氨酸在酶的作用下，经过一系列反应都生成了?Ｌ－哌可酸，Ｌ－哌可酸再经过反应生??－４－??

?第二章变异黄芪中产苦马豆素内生真菌的分离与鉴定??图２－２根据ＩＴＳ序列应用邻接法（ＮＪ）构建的系统发育树?‘??Ｆｉｇ．２?Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ?ｔｒｅｅ?ｃｏｎｔｒｕｃｔｅｄ?ｗｉｔｈ?ｔｈｅ?ｐｒｏｇｒａｍ?Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ（ＮＪ）ｂａｓｅｄ?ｏｎ?ＩＴＳ?ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ??注：比例尺代表碱基替换数；分支数字代表分类单位聚集在一起的几率；括号中的序号为各菌株ＩＴＳ序列在ＧｅｎＢａｎｋ中的登录号??Ｎｏｔｅ：Ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ?ｂｒａｎｃｈ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ?ｔｈｅ?ｅｘｐｅｃｔｅｄ?ｎｕｍｂｅｒ?ｏｆ?ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ．Ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｓ?ｏｆ?ｎｏｄｅｓ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ?ｔｈｅ?ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｔａｘａ?ｔｏ?ｔｈｅ?ｒｉｇｈｔ??ａｒｅ?ｐｌａｃｅｄ?ｔｏｇｅｔｈｅｒ?ｂｙ?ｔｌｉｅ?ｐｒｏｇｒａｍ．Ｔｈｅ?ｓｅｒｉａｌ?ｎｕｍｂｅｒｓ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｂｒａｃｋｅｔｓ?ａｒｅ?ＧｅｎＢａｎｋ?ａｃｃｅｓｓｉｏｎ?ｎｕｍｂｅｒｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＩＴＳ?ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ?ｏｆ?ｉｓｏｌａｔｅｓ??Ｕｎｄｉｆｉｌｕｍ?ｏｘｙｔｒｏｐｉｓ?ＤＡＯＭ?２３７６９６??Ｕｎｄ
【参考文献】

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本文编号：2837854