单核细胞增生李斯特菌强毒株新毒力基因的挖掘及功能初探

发布时间：2020-10-19 20:44

　　 单核细胞增生李斯特菌(Listeria mnocytogenes,Lm)和伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii,Li)作为李斯特菌属中唯一致病的两个种深受研究者的关注,其中Li主要感染羊、牛等反刍动物,极少引起人类的感染和发病;而Lm除感染动物外还能感染人类,引起人侵袭性和胃肠炎性李斯特菌病。Lm是兼性胞内寄生的病原体,能侵袭宿主的多种细胞(包括吞噬细胞、上皮细胞、内皮细胞等)进行增殖,并扩散到毗邻的细胞中。Lm能够突破宿主的三道屏障(胃肠道、胎盘和血脑屏障),引起的李斯特菌病致死率约为20-30%。虽然目前已经发现70多种毒力因子参与该病原菌的粘附、侵入和胞内增殖,但其与宿主互作与致病的分子机制尚未完全阐明,有待通过高通量的组学技术进行深入研究。本研究在前期对强毒株Lm XYSN全基因组测序的基础上,对Lm XYSN中新发现的伊氏李斯特菌来源的基因smcL及其功能进行研究,并初步探讨了其表达产物与李斯特菌溶血素O(listeriolysionO,LLO)之间的关系;此外,还利用动物模型从LmXYSN的转座子突变文库中筛选出与Lm XYSN的高致病力相关的新毒力因子。Lm XYSN中的毒力相关基因的挖掘及功能解析,有助于揭示该菌株高毒力的分子致病机制,为李斯特菌病的预防和控制提供科学的依据。1、自然重组单核细胞增生李斯特菌中smcL基因的功能研究将Lm XYSN smcL的基因序列与数据库进行比对,发现smcL的基因和与Li来源的基因序列同源性为97%,而迄今为止未见Lm中携带smcL基因的报道,因此这是首次在Lm中发现smcL基因。smcL基因编码的鞘磷脂酶C(SmcL)能特异性地作用于鞘磷脂,且具有一定的溶血活性,为Li的重要毒力因子,由此提示,SmcL蛋白的表达很可能在增强LmXYSN毒力中发挥重要作用。为了深入研究Li来源的smcL基因的功能,成功构建了Lm XYSN △hly、LmXYSN△smcL、Lm XYSN Ahly-AsmcL缺失突变株,以及能表达SmcL蛋白的Lm EGDe::pIMK2-smcL 和Lm NTSN::pIMK2-smcL菌株。与马红球菌(Rhodococcus equi,R.equi)的协同溶血试验表明,只有当Lm中smcL基因得到表达时,才会与R.equi形成铲形的溶血现象。通过测定突变株和重组菌株的溶血效价,发现smcL基因的缺失会导致LmXYSN溶血能力下降2倍,而其在Lm EGDe中的表达,则使重组菌株的溶血能力提高了 4倍,提示smcL基因显著增强了 Lm XYSN的溶血能力,很有可能有利于其在体内的感染和致病。对结肠腺癌上皮细胞系Caco-2 BBE进行的体外感染试验显示,smcL基因能显著提高Lm对该细胞系的粘附、侵袭和增殖能力。接下来以口服感染动物模型对smcL基因的功能进行了体内实验,结果表明,在感染72h以后,smcL和hly基因双缺失的突变株与hly基因单缺失的菌株相比,其在肠系膜淋巴结、肝脏和脾脏中的定殖能力显著降低(P0.01,P0.05,P0.05)。非常重要的是,smcL基因在NTSN中的重组表达显著增强了其在回肠和肠系膜淋巴结中的定殖能力(P0.01,P0.001)。总之,以上结果证明smcL基因作为Lm的独有基因,对其宿主体内的生存和内脏组织中的定殖中发挥重要作用,因此该基因是XYSN毒力增强的关键毒力因子之一。2、基于转座突变文库技术筛选的李斯特菌新毒力基因LMxysn_0620的功能研究以BALB/c小鼠口服感染动物模型,筛选Lm XYSN的转座子突变文库。从突变文库中随机挑取500个突变菌株进行口服感染实验,最后获得13株毒力下降100倍以上的突变株。通过反向PCR和基因测序后的比对分析,发现7株突变株的转座子插入位点基因与细胞生长代谢相关(xysn_1358、xysn_1979、n2165、xysn_2795、xysn_1812、sysn_2865、xysn_2030),3个基因分别与DNA的转录(xysn_0972)、蛋白质的修饰(xysn_1491、xysn_1284)相关,还有2个基因的功能是未知的(xysn_2490、xysn_0620)。利用小鼠口服感染突变株来测定 LD50,xysn_0620::Tn 的毒力(LDs0=107.85CFU)比Lm XYSN(LD50=105.08CFU)降低了 588倍,表明xysn_0620参与Lm XYSN感染小鼠的过程。构建xysn_0620基因的缺失突变株Lm XYSN △0620,对Lm XYSN △0620在不同培养条件下的生长能力进行测定,结果发现缺失突变株与亲本株在BHI培养基和在含有1%Triton的BHI培养基中的生长速率并无差异。在不同培养时间和温度下,对缺失株和野生株的生物被膜形成能力进行测定,结果表明,LmXYSN△0620在42℃形成生物被膜的能力均显著下降(P0.05,P0.01)。药敏试验发现xysn_0620基因缺失使细菌对克林霉素(Clindamycin,DA)的抗性由耐受变为中度敏感。以上结果提示,具有跨膜结构的xysn_0620基因编码产物可能为Lm XYSN的细胞结构成分。此外,体外细胞感染实验发现,xysn_0620基因的缺失会引起Lm XYSN对Caco-2BBE细胞黏附、侵袭、增殖的能力均显著性降低(P0.01,P0.05,P0.01)。最后对LmXYSN△0620缺失株在体内的感染动态进行测定,发现Lm XYSN △0620在小鼠脾脏中定殖的时间晚于野生菌株,在感染后的48h和72h,在脾脏中的定殖能力(P0.01,P0.001)和肝脏中的定殖能力(P0.05,P0.001)显著弱于野生菌株,提示其在脾脏和肝脏中的定殖能力显著弱于野生菌株。总之,XYSN_0620作为一跨膜蛋白,在Lm抗胁迫应答及对宿主内的侵袭、定植等致病过程中发挥着极其重要的作用。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.61
【部分图文】：

霉素和高温（４２°Ｃ）双重压力下进行传代，经ＰＣＲ鉴定后挑取重组菌株于双抗性ＢＨ［液??体培养基中培养以脱去抗性质粒。以ｈｌｙＷｌ／ｈｌｙＷ２为外围引物，ｈｌｙＮｌ／ｈｌｙＮ２为内侧引物，??鉴定ＺｗＸＹＳＮ的／＾基因是否缺失，结果如图１－３和１－４所示。将扩增出的ＰＣＲ产物送??至南京金斯瑞生物有限公司进行测序鉴定，测序结果正确表明已成功构建出ＸＹＳＮ??缺失株。??３０００＾４＇?－?７；＾３３９〇ｂｐ??％?２２５０ｂｐ＜?￣??：?崎一?＿?——＞１８〇７ｂＰ??：，６〇ｂｐ??ｍｕ??图１－３?Ｉｍ?ＸＹＳＮ?Ａ／？（ｙ鉴定结果?图１－４?ＸＹＳＮ?ＡＷ；；鉴定结果??Ｆｉｇ．?１－３?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｉＬｍ?ＸＹＳＮ?Ａｈｌｙ?Ｆｉｇ．?１－４?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆＺｗ?ＸＹＳＮ?Ａｂｌｙ??Ｍ：?ＤＬ２５０?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ?Ｍ：?ＤＬ２５０?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ??Ｋ?２，?３：?Ｔｈｅ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔ?ｏｆ?ｈｌｙＮｌ／ｈｌｙＮ２?１、２、３：?Ｔｈｅ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔ?ｏｆ?ｈｌｙＷｌ／ｈｌｙ＼Ｖ２??同理，利用引物ｓｍｃｌＰｌ、ｓｍｃｌＰ２、ｓｍｃｌＰ３、ｓｍｃｌＰ４扩增出规ｃＬ基因的上游片段ｓｍｃｌＦｌ，??和基因下游片段ｓｍｃｌＦ２

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以ｓｍｄＷｌ／ｓｍｃｌＷ２为外围引物，ｓｍｃｌＮｌ／ｓｍｃｌＮ２为内侧引物，鉴定Ｌｍ?ＸＹＳＮ和Ｌｍ??ＸＹＳＮＡ／ｚ／＿ｙ中的ｓｍｃＺ基因是否缺失，结果如图１－６和１－７所示。将扩増出的ＰＣＲ产物送??至南京金斯瑞生物有限公司进行测序鉴定，测序结果正确表明己成功构建出ＸＹＳＮ??Ｌｗ?ＸＹＳＮ?Ａ／ｚ／ｙ－ＡｓｗｃＺ?缺失株。??ｂｐ?ＸＹＳＮ?（１８０９ｂｐ）?Ｘ＼＇ＳＮＡｓｍｃｉ＜８０１＾）?ＸＴＳＸＡ＾ｍｒ／ＡＭＫＳＯｌｂｐ）??麟??图１－６外围引物ＰＣＲ鉴定ｓｍｃｌ缺失株结果??Ｆｉｇ．?１－６?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｓｍｃＬ?ｍｕｔａｎｔ?ｓｔｒａｉｎｓ?ｗｉｔｈ?ｓｍｃｌＷｌ／ｓｍｃｌＷ２??ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ：?ＤＬ２０００??戀??图１－７内围引物ＰＣＲ鉴定ｗＬ缺失株结果??１０Ｑ０?？?Ｆｉｇ．?１－７?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｓｍｃＬ?ｍｕｔａｎｔ?ｓｔｒａｉｎｓ?ｗｉｔｈ?ｓｍｃｌＮｌ／ｓｍｃｌＮ２??ｉ?＇?Ｐ?Ｍ：ＤＬ２５０?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ??２５〇?１，?２，?３，?４，?５：?Ｔｈｅ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔ?ｏｆ?ｓｍｃｌＮｌ／ｓｍｃｌＮ２??２．３重组表达ＳｍｃＬ菌株的构建??提取Ｌｍ?ＸＹＳＮ的基因组并作为模板，利用ｐＩＭＫ２Ｐｌ／ｐＩＭＫ２Ｐ２扩增出ｓｍｃＬ片段。利??用重组酶试剂ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓＴＭ?ＩＩ?Ｏｎｅ?Ｓｔｅｐ?Ｃｌｏｎｉｎｇ?Ｋｉｔ，将训。／／与线性化的ｐＩＭＫ２连接起??来。将连接产物热转至大肠杆菌ＤＨ５ａ中。对长出的菌落提取质粒进行ＰＣＲ鉴定
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 陈永辉,史贤明;利用转座子Tn917构建单核细胞增生李斯特菌菌膜形成突变株[J];微生物学报;2005年06期

本文编号：2847703