委内瑞拉马脑炎病毒三种检测方法的建立与初步应用

发布时间：2020-10-20 01:05

　　 委内瑞拉马脑炎(Venezuelan Equine Encephalitis,VEE)是由委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan Equine Encephalitis Virus,VEEV)引起的高致病性人兽共患传染病,马属动物是VEEV的扩增宿主。人经蚊虫叮咬感染VEEV后,主要呈现发热、头痛、关节炎及脑炎等临床症状。VEEV于1938年在病马中首次分离得到,随后研究证明,VEEV可通过气溶胶进行传播,易感性高,是潜在的危险生物战剂。因此,美国NIAID(National Institute of Allergy and Infectious Diseases)和CDC(Centers for Disease Control)将VEEV列为B类病原体。迄今,国内外尚无获批的人用VEE疫苗以及有效治疗药物。我国尚无VEE病例的相关报道,但经济贸易的全球化大大地增加了VEEV传入我国的风险。因此,出入境口岸必须加强对VEEV的检测,以确保从根源上阻断VEEV的传入。综上所述,我国急需建立快速、灵敏、简便的VEEV抗原、抗体检测方法。为此,本研究选用VEEV TRD强毒株基因序列,建立VEEV间接ELISA抗体检测方法、VEEV双抗体夹心ELISA抗原检测方法及基于VEEV假病毒的中和抗体检测方法,以期为VEE疫情监测和VEEV抗原、抗体检测提供技术支持。1.委内瑞拉马脑炎病毒间接ELISA抗体检测方法的建立及应用本研究利用大肠杆菌表达系统表达VEEV E2蛋白胞外区(tE2),优化诱导条件后,纯化目的蛋白tE2;利用纯化的tE2作为包被抗原建立VEEV间接ELISA抗体检测方法,并对该方法的工作条件进行优化,随后对该方法进行评价,检测其特异性、重复性和敏感性。结果显示,通过PCR扩增的方法,凝胶电泳可见大小约为1023 bp的tE2基因片段,成功构建重组质粒pET-30a(+)-VEEV-tE2,经鉴定,tE2主要以包涵体形式存在,且在37℃、0.6mM IPTG诱导3 h条件下tE2表达量最高;纯化的tE2经薄层扫描纯度可达94%。以纯化的VEEV tE2为包被抗原,建立VEEV间接ELISA抗体检测方法,优化后的工作条件:抗原最佳包被浓度为10μg/m L,4℃孵育过夜;封闭液Super Blocking Buffer 37℃封闭1.5 h;待检测血清1:40稀释,37℃孵育1.5 h;HRP标记的羊抗兔IgG抗体1:10000稀释,37℃孵育1 h。建立的VEEV间接ELISA抗体检测方法可特异性识别VEEV阳性抗体;批间与批内变异系数均小于8%,重复性良好。综上所述,成功建立简便、快速、高通量的VEEV间接ELISA抗体检测方法。2.委内瑞拉马脑炎病毒假病毒中和抗体检测方法的建立与应用构建包含VEEV E3-E2-6K-E1(E_(123))的真核表达质粒,将重组质粒与慢病毒包装质粒pNL4-3.Luc.RE共转染293T细胞,培养48h后收获假病毒;利用电镜及Western Blot鉴定假病毒,对假病毒进行易感细胞的筛选后,进行假病毒感染力的测定;利用VEEV假病毒建立中和抗体检测方法,对相关样品进行检测。结果显示,成功构建pCAGG-VEEV-E_(123)并与pNL4-3.Luc.RE共转染293T细胞,收获假病毒上清pVEEV-E_(123)。经Western Blot鉴定,p VEEV-E_(123)泳道可见42 kD的VEEV E2蛋白条带和24 kD的HIV-1 P24蛋白条带,透射电镜下pVEEV-E_(123)上清中可观察到与HIV大小相近的假病毒粒子。将pVEEV-E_(123)感染NA、Huh-7、BSR、BHK-21和Vero E6细胞,结果表明pVEEV-E_(123)对Huh-7细胞感染力最强。故基于pVEEV-E_(123)建立了VEEV中和抗体检测方法,该方法可特异性检测VEEV中和抗体,重复性良好。该方法可用于血清样品的中和抗体检测。综上所述,成功地建立了VEEV假病毒系统,并将其应用于VEEV中和抗体的检测,降低了VEEV研究中操作活毒的生物安全风险。3.委内瑞拉马脑炎病毒双抗体夹心ELISA抗原检测方法的建立及应用利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统,制备表达VEEV t E2的重组杆状病毒rpFBD-2tE2。将纯化的tE2免疫家兔,制备兔源多克隆抗体;选用VEEV单克隆抗体作为捕获抗体、兔源多克隆抗体作为检测抗体,建立可定量检测rpFBD-2tE2及VEEV-V5(表达C-E3-E2-6K-E1的重组杆状病毒)中E2蛋白含量的VEEV双抗体夹心ELISA抗原检测方法;对该方法工作条件进行优化,并对其敏感性、特异性、重复性进行评价。结果显示,捕获抗体的最佳包被浓度为8μg/m L,检测抗体的最佳稀释度为1:1600,检测限为8.619 ng/m L。该方法可特异性检测出VEEV重组杆状病毒rpFBD-2tE2及VEEV-V5,与其他病毒样颗粒上清不发生反应,且批间及批内变异系数均小于10%。利用该方法测得重组杆状病毒rpFBD-2tE2中E2蛋白的相对含量在739.89~1025.17 ng/m L,VEEV-V5中E2蛋白含量在10.68~38.90 ng/m L。综上所述,成功地建立了VEEV双抗体夹心ELISA抗原检测方法;该方法可用于VEE亚单位疫苗中E2蛋白含量的检测,为疫苗的评价及疫情监测提供技术支持。综上所述,本研究建立了三种快速、简便的VEEV检测方法,为VEE疫情监测、新型疫苗的抗原定量以及免疫效果评价等奠定了基础。
【学位单位】：军事科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：

arker DL2000 1. VEEV tE2 基因1.1 PCR 扩增 VEEV tE2 基因电泳phoretic profile of PCR product of构建及鉴定pET-30a(+)片段进行连接，连CR 鉴定，经 1%琼脂糖凝胶 GenBank 中收录的基因序列

arker DL2000 1. VEEV tE2 基因 1.1 PCR 扩增 VEEV tE2 基因电泳rophoretic profile of PCR product of 的构建及鉴定 pET-30a(+)片段进行连接，连 PCR 鉴定，经 1%琼脂糖凝胶与 GenBank 中收录的基因序列

导的空载体 2. IPTG 诱导 3 h 空载体 诱导 3 h 重组菌图 1.3 目的蛋白诱导表达的 Western Bl.3 SDS-PAGE profile of expressed target 导表达条件的优化的优化G 分别诱导 1、2、3、4、5、6、7、显，本着“节约成本”的原则，确定
【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 曹增国;王化磊;王丽娜;杨松涛;夏咸柱;;委内瑞拉马脑炎疫苗研究进展[J];传染病信息;2015年02期

2 千莎莎;何彪;涂忠忠;郭焕成;涂长春;;委内瑞拉马脑炎病毒一步法荧光定量RT-PCR方法的建立[J];病毒学报;2015年02期

3 李云云;郭万柱;;乙型脑炎新型疫苗的研究进展[J];当代畜牧;2014年15期

4 李琳;郭彦;赵光宇;于虹;孙世惠;潘婷;唐健;周育森;樊卫平;;中东呼吸综合征冠状病毒假病毒系统的建立及其在中和抗体检测中的应用[J];生物技术通讯;2014年02期

5 夏咸柱;;关口前移,从源头防控人兽共患病[J];兽医导刊;2012年09期

6 Maria Trovato;Shelly J Krebs;Nancy L Haigwood;Piergiuseppe De Berardinis;;Delivery strategies for novel vaccine formulations[J];World Journal of Virology;2012年01期

7 王振东;王林林;杨宇;杨永莉;王静;;委内瑞拉马脑炎病毒重组抗原的制备纯化及其胶体金免疫层析检测方法的建立[J];中国生物工程杂志;2011年07期

8 姜涛;邓永强;于曼;陈水平;秦成峰;秦鄂德;;3种重要脑炎病毒的多重RT-PCR检测方法的建立[J];军事医学科学院院刊;2007年03期

9 邓永强;姜涛;于曼;陈水平;秦成峰;刘伯华;祝庆余;秦鄂德;;实时RT-PCR法检测感染小鼠不同组织标本中的委内瑞拉马脑炎病毒[J];中国人兽共患病学报;2006年11期

10 庞乐君;张新民;;委内瑞拉马脑炎[J];传染病信息;2004年02期

相关硕士学位论文 前3条

1 王琪;马尔堡病毒抗原、抗体ELISA检测方法的建立与评价[D];吉林农业大学;2017年

2 张金勇;基孔肯雅病毒E1重组腺病毒候选疫苗的构建鉴定、免疫评价及免疫动物体内残留检测[D];吉林农业大学;2017年

3 曹增国;西尼罗病毒快速检测方法的建立与应用[D];中国人民解放军军事医学科学院;2016年

本文编号：2847975