中国和巴基斯坦部分地区牛梨形虫病病原分子流行病学、血清学研究

发布时间：2020-10-23 10:37

　　 泰勒虫病是由媒介蜱传播的泰勒虫寄生于宿主红细胞或网状内皮细胞所引起的血液原虫病,发病动物以发热、贫血、黄疸、体表淋巴结肿胀,甚至死亡,为典型临床症状。据报道,梨形虫病每年在全世界范围内造成数十亿美元的经济损失,包括动物死亡、生产性能下降及防治费用。因此,建立快速特异的诊断检测方法,并对牛泰勒虫病的流行情况进行调查,阐明中国和巴基斯坦两国部分地区的梨形虫种类与分布特征,可为牛梨形虫病的防控提供技术支撑和理论依据。依据环形泰勒虫烯醇化酶基因序列,设计引物,建立了可扩增大小281bp基因片段的RPA快速检测方法。对建立的RPA方法和常规PCR方法的检测效果进行了对比,通过对274份野外样本的检测,RPA方法检测出48份阳性样品(17.51%),常规PCR检测出21份环形泰勒虫阳性样品(7.66%),结果显示RPA检测方法的敏感性明显高于常规PCR。为证实RPA检测结果的正确性,对RPA检测呈阳性而常规PCR为阴性的样品进行了测序验证。在野外环境下,环形泰勒虫与东方泰勒虫经常以混合感染的情况出现。为能够同时并鉴别诊断两种泰勒虫,本研究中建立了能够同时检测环形泰勒虫和东方泰勒虫的多重RPA检测方法。根据两种泰勒虫的烯醇化酶基因序列,分别设计了特异性扩增引物,其中,环形泰勒虫的扩增片段长度为282 bp,东方泰勒虫的扩增片段长度为229 bp。特异性试验证实,该方法可特异性地扩增两种泰勒虫,而与其他梨形虫DNA无交叉反应,特异性良好。敏感性试验结果显示,该多重RPA检测方法最低能够检出100拷贝的烯醇化酶基因的质粒DNA,具有较好的检测敏感性。为验证多重RPA检测方法的应用价值,分别用建立的多重RPA方法和已报道的多重PCR检测方法,对188份样品中环形泰勒虫和东方泰勒虫的感染情况进行了检测。多重RPA检测出环形泰勒虫阳性样品45份(23.9%)和东方泰勒虫阳性样品5份(2.6%)。多重PCR方法检测出环形泰勒阳性32份(17%)和东方泰勒虫阳性3份(1.6%)。为了解巴基斯坦梨形虫病的流行情况,在Chakwal、Jhang和Faisalabad三个地区,选择有蜱叮咬但无临床症状的牛,用FTA卡共采集血液样品450份。应用已发表的针对梨形虫18S rRNA V4高变区的巢式PCR方法,对采集的样品进行检测。测序结果显示,在样品采集地区主要存在环形泰勒虫、东方泰勒虫和双芽巴贝斯虫。采集的样品中,梨形虫病病原的阳性率为28.44%(128/450)。其中环形泰勒虫阳性率为22.89%、东方泰勒虫阳性率为3.11%、双芽巴贝斯虫阳性率为2.44%。样品采集的三个地区中,Chakwal地区梨形虫病流行情况最为严重,梨形虫感染阳性率达58.51%。为进一步了解巴基斯坦和中国地区梨形虫病病原的基因相关性。从中国内蒙古地区的120份样品中筛选出梨形虫阳性DNA样品16份,与巴基斯坦地区筛选出的梨形虫基因序列进行基因相关性分析。核糖体18S rRNA全长序列和棒状体相关蛋白基因分别用于泰勒虫和双芽巴贝斯虫的基因相关性分析。采用以重组的主要梨形虫表面蛋白(rMPSP)为抗原建立的间接ELISA方法,对来自西藏、新疆和内蒙3个省份44个地区的840份牛血清样品进行了检测。结果显示,样品的平均阳性率为18.57%。新疆、内蒙和西藏的阳性率分别为27%、14%和10.94%。本项研究结果,可为巴基斯坦和我国牛泰勒虫病防控提供了理论依据。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S858.23
【文章目录】：
摘要
abstract
英文缩略表
CHAPTER Ⅰ INTRODUCTION
    1.1 Taxonomy and biological features of piroplasms
    1.2 Piroplasm infecting ruminants
        1.2.1 Theileria
        1.2.2 Babesia
        1.2.3 Life Cycle of Piroplasms
    1.3 Distribution of piroplasm species
    1.4 Diagnostic methods to detect and identify piroplasm species
        1.4.1 Conventional techniques
        1.4.2 Serological assays
        1.4.3 Molecular assays
    1.5 Piroplasm detection studies
        1.5.1 Piroplasm detection in China
        1.5.2 Piroplasm detection in Pakistan
    1.6 Piroplasma Control
        1.6.1 Vector control
        1.6.2 Babesia and Theileria control
CHAPTER Ⅱ DEVELOPMENT OF RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION
    2.1 Introduction
    2.2 Materials and methods
        2.2.1 Parasites
        2.2.2 Samples collection
        2.2.3 Detection of Theileria annulata by RPA
        2.2.4 Sensitivity of RPA
        2.2.5 Specificity of RPA
        2.2.6 Field samples screening
        2.2.7 Statistical analysis
    2.3 Results
        2.3.1 Specificity of RPA
        2.3.2 Sensitivity of RPA
        2.3.3 Results of field samples
    2.4 Discussion
CHAPTER Ⅲ DEVELOPMENT OF MULTIPLEX RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION
    3.1 Introduction
    3.2 Materials and methods
        3.2.1 Parasites
        3.2.2 Samples collection
        3.2.3 Simultaneous detection of T. annulata and T. orientalis
        3.2.4 Sensitivity of multiplex RPA
        3.2.5 Specificity of multiplex RPA
        3.2.6 Field samples screening
    3.3 Results
        3.3.1 Specificity of multiplex RPA
        3.3.2 Sensitivity of multiplex RPA
        3.3.3 Results of field samples
    3.4 Discussion
CHAPTER Ⅳ MOLECULAR EPIDEMIOLOGY OF PIROPLASM SPECIES
    4.1 Introduction
    4.2 Materials and methods
        4.2.1 Samples collection
        4.2.2 Genomic DNA extraction
        4.2.3 Primer design
        4.2.4 PCR amplification, cloning and sequencing
        4.2.5 Confirmation and sequence analysis of positive samples
        4.2.6 Phylogenetic analysis
        4.2.7 Species confirmation
        4.2.8 Nucleotide accession numbers
    4.3 Results
        4.3.1 Detection and identification of parasite in samples collected from Pakistan
        4.3.2 Detection and identification of parasite in samples collected from China
    4.4 Discussion
CHAPTER Ⅴ SEROLOGICAL DETECTION OF THEILERIOSIS
    5.1 Introduction
    5.2 Materials and methods
        5.2.1 Parasites
        5.2.2 Sera and genomic DNAs
        5.2.3 Cloning and expressing MPSP gene
        5.2.4 Western blotting
        5.2.5 ELISA procedure
    5.3 Results
        5.3.1 Serological prevalence of Theileriosis
    5.4 Discussion
CONCLUSION
REFERENCES
ACKNOWLEDGEMENTS
CURRICULUM VITAE

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本文编号：2852924